凉膈散、银翘散对早期脓毒症炎症因子干预作用比较研究

何宜荣，赵国荣，肖碧跃,何栋,贺又舜,艾碧琛*

(1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学研究生院，湖南长沙410208)

凉膈散、银翘散对早期脓毒症炎症因子干预作用比较研究

何宜荣1，赵国荣，肖碧跃1,何栋2,贺又舜1,艾碧琛1*

(1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学研究生院，湖南长沙410208)

目的观察凉膈散、银翘散对早期脓毒症炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10的不同干预作用。方法将40只新西兰大耳白兔随机分成空白对照组、模型组、银翘散治疗组、凉膈散治疗组、地塞米松对照组，采用耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素的方法建立脓毒症模型，造模0.5 h后药物干预，4 h后观察兔一般情况及体温，检测血浆内毒素、促炎因子IL-1β、TNF-α及抗炎因子IL-10水平。结果银翘散组兔全身情况好转，体温、血浆内毒素、IL-1β、TNF-α的水平均比模型组降低（P＜0.01 or 0.05）；凉膈散组兔全身症状加重，体温、血浆内毒素、IL-1β、TNF-α、IL-10与模型组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论银翘散能抑制早期脓毒症卫分证相关阶段促炎因子IL-1β、TNF-α的释放而减轻炎症反应、改善症状，但凉膈散不能抑制IL-1β、TNF-α释放、减轻炎症反应。

银翘散；凉膈散；脓毒症；卫分证；炎症因子

脓毒症是感染导致宿主过度炎症反应的一组临床表现综合征，是严重感染、烧伤、休克、创伤、大手术后常见的并发症，也是危重患者重要的死亡原因。脓毒症常可导致全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等，尽管抗感染和器官功能支持技术取得了较大进步，但其病死率仍很高，已成为现代医学面临的常见而复杂的难题。脓毒症的发病机制涉及全身炎症网络效应、免疫功能障碍、凝血异常、代谢紊乱甚至基因多态性等多个方面，其中全身炎症网络效应尤为突出，但随之提出的许多方法诸如IL-1受体拮抗剂、IL-8单克隆抗体、肿瘤坏死因子拮抗剂等，并未能取得预期效果。

临床中不乏治疗脓毒症有效的中医治法与方药，但其调节炎症网络机制尚未阐明，且多是基于脓毒症轻症（早期）、重症、或危急重症而治，未明确辨证，未有效体现“病证结合，方证对应”，在一定程度上影响了疗效的提高。本课题组在以往内毒素血症与卫气营血辨证相关性研究基础上[1-3]开展动物实验，以早期脓毒症卫分证相关阶段为切入点，比较银翘散、凉膈散对早期脓毒症炎症网络的不同干预作用，初步尝试将临床证实有效的脓毒症治法方药与卫气营血辨证相联系，以使脓毒症的中医治疗更具针对性，也有利于建立脓毒症中医辨证论治诊疗方案。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 药物银翘散：连翘30 g，金银花30 g，桔梗18 g，薄荷18 g，竹叶12 g，生甘草15 g，荆芥穗12 g，淡豆豉15 g，牛蒡子18 g，芦根煎汤[4]。凉膈散：川大黄9 g，朴硝9 g，甘草9 g，山栀子仁5 g，薄荷5 g，黄芩5 g，连翘18 g，竹叶5 g，白蜜5 g[4]，均由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供；地塞米松片为浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号140543。灌胃前一天地塞米松片以蒸馏水溶解，银翘散、凉膈散按常规煎煮方法煎煮，根据体表面积-剂量换算法[5]计算每公斤体质量给药量，然后按10 mL/㎏灌胃量配制成相应浓度的药液，4℃保存备用。

1.1.3 试剂大肠杆菌内毒素Escherichia coli 0111:B4购自美国SIGMA-ALDRICH公司（生产批号114M4009V），无菌条件下用生理盐水配制成20 μg/mL的溶液，使用前以温水温浴至39℃。内毒素检测鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司（生产批号140430）。IL-1β、TNF-α、IL-10 ELISA Kit购自武汉博士德生物工程有限公司（批号分别为EK0393，EK0527，EK 0417）。

1.1.4 主要仪器与设备MK3酶标仪(芬兰LABSYSTEMS集团)，UV-1900PC紫外分光光度计（美析），KDC-2046低温大容量离心机(中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司)，ELT-13V-85V34超低温冰箱(美国HARRIS公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组将40只兔子先按性别和体质量分层，后按样本分配随机数字表法分成5组，每组8只，分别为空白对照组、模型组、银翘散治疗组（以下简称“银翘散组”）、凉膈散治疗组（以下简称“凉膈散组”）、地塞米松对照组（以下简称“地塞米松组”）。

1.2.2 造模在脓毒症中，失控的炎性反应、免疫功能紊乱等均由内毒素直接或间接触发[6]，脓毒症模型采用前期以兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素初步建立的内毒素血症卫分证、气分证、营血分证相关模型（兔耳缘静脉注射10 μg/kg的内毒素后至两小时的阶段与卫分证相关）[1-3]。模型组、银翘散组、凉膈散组、地塞米松组均经耳缘静脉注射内毒素10 μg/ kg造模，空白组注射等容量生理盐水。

1.2.3 给药根据体表面积-剂量换算法[5]计算，银翘散每公斤兔每次给药量为4.1 g，根据兔灌胃容量10 mL/kg将凉膈散配制成浓度为0.041 g/mL的药液；凉膈散每公斤兔每次给药量为1.7 g，根据兔灌胃容量10 mL/kg将凉膈散配制成浓度为0.17 g/mL的药液；地塞米松每公斤兔每次给药量为0.036 mg，按10 mL/㎏灌胃容量配制成0.0 036 mg/mL的药液。注射内毒素后0.5 h，银翘散组、凉膈散组、地塞米松组分别给予相应药物灌胃10 mL/kg，空白组与模型组则以等容量温开水灌胃，各组均灌胃1次。

聚合物灌装方法虽然有很多优势,但也有弊端,最突出的弊端就是加剧了结构中的热应力[3]。其原因来源于几个方面:(1)聚合物的热膨胀系数往往远大于电子器件材料,从而加剧了结构中热膨胀系数的不匹配;(2)聚合物往往是不良热导体,所以灌装后的电子器件在工作时会产生更高的温度;(3)在浇注聚合物时,材料的相变会产生额外的热应力。因此,研究聚合物灌装方法中的热应力对该方法的可行性有着重要意义。

1.2.4 实验观察观察期从注射内毒素开始至注射后4 h。（1）一般情况观察：兔的全身状态、精神状态、饮水及进食情况、大小便、皮肤、耳廓、结膜、舌象等变化；（2）体温：实验前24 h内测体温3次，取平均值为基础体温。注射内毒素4 h测体温，计算各组发热净增值（△T）平均值，△T=实时体温-基础体温；（3）血浆内毒素及炎症因子：第4小时对各组兔进行心脏采血20 mL，其中5 mL放入无热原肝素抗凝管，低温离心机中3 000 r/min提取血浆，放入无热原管，按照试剂盒说明书操作步骤检测血浆内毒素（终点显色法）。另15 mL以低温离心机3 000 r/min离心10 min，常规分离血清，于-70℃冰箱内冻存，采用ELISA法集中成批检测IL-1β、TNF-α、IL-10，按试剂盒说明书进行检测。

1.2.5 统计方法采用spss 19.0软件进行统计分析。所有实验数据换算成“±s”表示，进行单因素方差分析，若方差齐，进一步组间两两比较用t检验。若方差不齐，则用非参数检验的Tamhane'sT2法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

注射内毒素后0.5 h，模型组、银翘散组、凉膈散组、地塞米松组兔出现懒动、少食少饮，部分兔出现耸毛、发抖、喷嚏，大小便正常。药物干预后，银翘散组、地塞米松组兔全身情况逐渐好转；模型组、凉膈散组耸毛、发抖、喷嚏逐渐消失，仍懒动、蜷缩、少食少饮，在2～3 h后活动逐渐增加，饮水增加，小便黄、少，部分兔出现便溏、水样便或黏液便，呼吸、心率增加。空白组兔未见上述表现。各组兔在观察期均未见明显球结膜充血、耳廓及皮下出血点。

2.2 各组发热净增值（△T）比较

与空白组比较，模型组、凉膈散组体温升高（P＜0.01），地塞米松组及银翘散组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，地塞米松组及银翘散组体温升高不明显（P＜0.01），凉膈散组差异无统计学意义（P＞0.05）；凉膈散组体温比地塞米松组及银翘散组体温升高（P＜0.01）；地塞米松组与银翘散组之间差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。

2.3 各组血浆内毒素水平比较

与空白组比较，模型组、凉膈散组内毒素水平升高（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组比较，凉膈散组差异无统计学意义（P＞0.05）；地塞米松组、银翘散组内毒素水平升高不明显（P＜0.01），与地塞米松组和银翘散组比较，凉膈散组内毒素水平升高（P＜0.05）；地塞米松组与银翘散组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

2.4 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平比较

与空白组比较，各组IL-1β、TNF-α均升高，模型组、凉膈散组IL-10升高（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组IL-1β、TNF-α、IL-10降低（P＜0.01或P＜0.05），银翘散组IL-1β、TNF-α、IL-10均降低（P＜0.01或P＜0.05），凉膈散组IL-1β、TNF-α、IL-10差异无统计学意义（P＞0.05）；与地塞米松组比较，银翘散组IL-1β、TNF-α、IL-10差异无统计学意义（P＞0.05），凉膈散组IL-1β、TNF-α、IL-10升高（P＜0.01或P＜0.05）；与银翘散组比较，凉膈散组IL-1β、TNF-α、IL-10升高（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表2。

表1 各组发热净增值（△T）、血浆内毒素比较（±s，n=8）

表1 各组发热净增值（△T）、血浆内毒素比较（±s，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与地塞米松组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与银翘散组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01。

组别空白组模型组地塞米松组银翘散组凉膈散组F值P值△T 0.05±0.03 1.25±0.47** 0.08±0.06△△0.07±0.04△1.40±0.63**▲▲○○19.64＜0.001内毒素（EU/mL）0.26±0.09 0.45±0.17** 0.30±0.11△0.28±0.23△0.37±0.16*▲○6.11＜0.01

表2 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平比较（±s，n=8）

表2 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平比较（±s，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与地塞米松组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与银翘散组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01。

组别空白组模型组地塞米松组银翘散组凉膈散组F值P值IL-1β(pg/mL) 18.25±4.12 42.32±9.26** 23.47±9.11*△△21.99±6.58*△△36.67±10.45**▲▲○○17.63＜0.001 TNF-α(ng/mL) 0.56±0.21 1.07±1.13** 0.72±0.51*△0.79±0.44*△0.95±0.88**▲○6.98＜0.01 IL-10(pg/mL) 26.55±16.21 35.49±9.25* 22.25±10.40△△25.11±13.50△34.27±15.61*▲▲○○11.39＜0.001

3 讨论

中医学没有脓毒症的概念，因其由感染所致，以发热为核心征象，还常见心动过速、呼吸急促等症状，故属中医学“外感热病”范畴，脓毒性休克和MODS则属于“厥证”、“脱证”。叶天士创立的卫气营血辨证至今300多年，一直有效指导临床辨证治疗外感热病，“卫之后方言气，营之后方言血”，由卫而气而营而血，是病邪由浅入深，病情由轻转重的变化过程。脓毒症SIRS至严重脓毒症或脓毒性休克、MODS是一动态的连续过程，其演变规律类似卫气营血的变化，故现在多数学者认为脓毒症与卫气营血辨证各阶段证候的表现存在大致对应关系：脓毒症前驱期或急性典型期之早期与卫分证类似，急性典型期与气分证类似，SIRS阶段主要表现类似气分证乃至营分证的一些特点，严重脓毒症、脓毒性休克及后期发展的MODS则类似营分证或者血分证[6-7]。

研究表明在脓毒症中，失控的炎性反应、免疫功能紊乱、高代谢状态及多器官功能损害均由内毒素直接或间接触发[8]。内毒素主要通过促使单核-巨噬细胞等释放大量炎性细胞因子，脓毒症早期主要是感染引起的以大量促炎介质释放为主要特征的炎症反应综合征期，此期细胞免疫状态是增高的。早期主要产生TNF-α、IL-1β等前炎症细胞因子激发SIRS，之后随着脓毒症促炎反应发展，机体启动代偿性抗炎反应机制，产生IL-10等抗炎细胞因子以拮抗过度产生的前炎症细胞因子[9]。促炎反应／抗炎反应动态变化可造成机体的免疫病理损伤。故TNF-α、IL-1β、IL-10三者是SIRS的重要动态监测指标。银翘散出自清代医家吴鞠通所著《温病条辨》，为辛凉平剂，具有辛凉解表、清热解毒之功效，主治风温初起，现代研究发现银翘散有明显的抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏的作用，是温病卫分证临床常用方剂；糖皮质激素具有强大的抗炎作用，可显著改善脓毒症患者的预后，小剂量糖皮质激素（如地塞米松）常用于脓毒症治疗。本实验给兔注射内毒素造脓毒症模型，注射内毒素1 h后给予银翘散、地塞米松干预治疗，结果发现银翘散组体温下降，全身情况好转，同时银翘散降低了血浆内毒素、促炎因子IL-1β、TNF-α的水平，与地塞米松组无明显差异。可见在此阶段银翘散发挥了较好的治疗作用，其作用机制之一是通过抑制促炎因子的释放而减轻炎症反应。这反过来也提示兔耳缘静脉注射内毒素后的1 h阶段与卫分证相关，与前期实验结果一致[1-3]。

凉膈散出自《太平惠民和剂局方》，泻火通便、清上泄下，能有效抑制内毒素导致的炎症反应、减轻组织病理损害、降低死亡率，从功效来看属于气分证的“清气法”。实验中给兔注射内毒素后1 h以凉膈散灌胃后至4 h，兔体温升高，全身症状无缓解，并且进一步加重，血浆内毒素、促炎因子IL-1β、TNF-α水平没有降低，与模型组差异不显著，根据前期研究结果，此期相当于已进入脓毒症气分证相关阶段[1-3]，说明凉膈散未能及时控制病情发展。此外，IL-10为抗炎因子，感染初期尚不足以调动机体的自我调节机制来促进抗炎因子的释放，IL-10水平并不会升高，随病情加重、炎症反应增强才会逐渐释放出来。本实验中银翘散组、地塞米松组IL-10与空白组无差异，而模型组、凉膈散组IL-10升高，这也说明此阶段应用凉膈散不能控制病情发展。可见，尽管有实验研究证实加味凉膈散在早期脓毒症解毒抗炎、攻邪安正方面显示出良好的治疗作用，能有效防止脓毒症的进一步恶化[10]，但若过早应用，即在脓毒症早期的卫分证阶段即用凉膈散来“清”，则违背了叶天士“到气才可清气”之意，可能会使邪气被凉遏而无法外达，此期应用凉膈散则弊大于利，而银翘散的辛凉解表之法才更合适。这从另一个角度说明卫气营血理论指导感染性疾病的治疗疗效卓著，是因为在不同阶段根据不同证候采用不同的方法治疗，这正是叶天士“在卫汗之可也，到气才可清气”的辨证施治内涵之一。

[1]艾碧琛，赵国荣，贺又舜，等.卫气营血阶段性与内毒素血症兔不同时相症状、体征的相关性研究[J].湖南中医药大学学报，2011，31（3）：20-23.

[2]赵国荣，艾碧琛，贺又舜，等.内毒素血症兔症状、体征动态变化与卫气营血传变的相关性[J].中医杂志，2011，52（15）：1305-1307.

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[4]李飞.中医药学高级丛书·方剂学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2011:183，499.

[5]贺石林.中医科研设计与统计学[M].长沙：湖南科学技术出版社. 2012：48-49.

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（本文编辑 杨 瑛）

Comparisons of the Effects of Liangge Powder and Yinqiao Powder on Inflammatory Cytokines in Early Stage of Sepsis

HE Yirong1,ZHAO Guorong1,XIAO Biyue1,HE Dong2,HE Youshun1,AI Bichen1*
(1.College of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China；
2.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo observe different effects of Liangge Powder and Yinqiao Powder on inflammatory cytokines IL-1β,TNF-αandIL-10inearlystageofsepsis.Methods40rabbitswererandomlydividedintoblankcontrol group,model group,Yinqiao Powder therapy group,Liangge Powder therapy group and dexamethasone control group.The sepsis model was established by injecting LPS into rabbits'ear vein,which was given drug intervention after 0.5 h of modeling.After 4 h of modeling,the general conditions,temperatures,levels of plasma endotoxin,IL-1β,TNF-α and IL-10 were observed.ResultsSymtoms in Yinqiao Powder therapy groups were relieved,and their temperatures,levels of plasma endotoxin,IL-1β and TNF-α decreased compared with model group(P＜0.01 or P＜0.05).Symptoms in Liangge Powder therapy group turned into more serious,levels of plasma endotoxin,IL-1β,TNF-α and IL-10 had no significant difference compared to model group(P＞0.05).ConclusionYinqiao Powder can inhibit the releases of pro-inflammatory cytokines of IL-1β and TNF-α in Weifen syndrome related phase of early stage of sepsis,and it can reduce the inflammatory reaction and relieve the symptoms,while Liangge Powder can not.

Yinqiao Powder;Liangge Powder;sepsis;Weifen syndrome;inflammatory cytokines

R285.5；R631+.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.12.002

2016-06-21

国家自然科学基金项目（30801473，81603535），湖南省自然科学基金项目（14JJ3119），湖南中医药大学“中医经典理论与经方应用研究”科技创新团队项目，湖南中医药大学中医临床基础重点学科。

何宜荣，男，硕士，讲师，研究方向:温病经典方药防治肝病及感染性疾病的临床及实验研究。

*艾碧琛，女，博士，副教授，硕士研究生导师，E-mail:52304421@qq.com。