药物肾毒性生物标志物研究进展Δ

杜海燕，戴 路，谢海琴，林 阳

(1.首都医科大学附属北京安贞医院药事部/药物临床试验机构，北京100029； 2.首都医科大学2011级临床医学专业本科生，北京 100069)

·本期特稿·

药物肾毒性生物标志物研究进展Δ

杜海燕1*，戴 路2，谢海琴2，林 阳1#

(1.首都医科大学附属北京安贞医院药事部/药物临床试验机构，北京100029； 2.首都医科大学2011级临床医学专业本科生，北京 100069)

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.06.001

肾脏是药物毒性作用的重要靶器官，约20%的肾毒性由药物引起。临床上，早期肾损伤难于发现，采用传统肾功能检测方法发现血肌酐、尿素氮水平升高时，细胞损伤已超过70%～80%[1]，肾脏往往已发生严重损害，甚至功能衰竭。近年来，屡有上市新药因毒性问题被撤市或限制使用。因此，尽可能早地发现药物的肾毒性，不仅能为临床用药安全提供保障，还能大大降低药物开发风险。但是，目前对药物肾毒性尤其是慢性毒性的预测严重不足，药物肾毒性经常被漏估或低估，其主要原因之一是缺乏灵敏、可靠、专属性强的评价指标。近年来，在探索肾毒性生物学标志物方面有了一些研究进展，部分项目已用于临床早期发现和诊断肾损伤，受到了广泛关注和重视。现对近年来新发现的肾毒性早期诊断及预后评估的标志物进行综述，为新药研发及指导临床安全用药提供依据。

1 蛋白多肽类标志物

2008和2010年，美国食品药品监督管理局和欧洲药物管理局分别接受药物安全性预测联盟(predictive safety testing consortium，PSTC)和国际生命科学学会健康和环境科学研究所的申请，认可了8种肾毒性生物标志物用于药物临床前安全性评价[2]，同时也为现有的检测指标提供了补充信息[3]。其中，丛生蛋白、肾损伤分子-1(Kim-1)、三叶因子-3、白蛋白和肾乳头抗原-1作为药物肾小管损伤生物标志物，而尿总蛋白(uTP)、β2-微球蛋白(β2-MG)、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)作为药物肾小球损伤(或肾小管重吸收障碍)生物标志物。PSTC指出，在药物临床前试验出现肾毒性时，可以考虑运用尿液Kim-1、白蛋白、uTP、CysC和β2-MG监测早期临床试验的肾脏毒性[2]。但迄今为止，以上8个肾损伤生物标志物依然没有取代血清尿素氮和血清肌酐，而是作为传统指标与肾脏病理的补充。

另外，一些尿酶能够联合运用有效预测早期肾毒性[4]。尿酶的检测可以在全自动生化分析仪上完成，简单快速，如来自溶酶体的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶是特异、灵敏的肾小管损伤标志物，且较稳定；来自肾小管上皮细胞的α-谷胱甘肽转移酶、丙氨酸氨基肽酶(AAP)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)、乳酸脱氢酶等尿酶可预测肾小管损伤，但是部分尿酶如γ-GGT、AAP、ALP等在尿液中不稳定且个体差异大，从而限制了其广泛应用。此外，也有新的肾毒性生物标志物如血管非炎性蛋白、细胞色素C等被发现具有预测早期肾损伤的潜力。为了加快这些生物标志物的验证和应用，需要更深入了解生物标志物在药物造成肾毒性过程中的产生机制和动态变化[5]。

2 核酸类标志物

利用毒理基因组学发现肾毒性相关的核酸类生物标志物，是近年来研究的热点之一。该技术通过对药物作用后基因表达的改变与药物毒性之间的关系进行分析，比较大量同类药物作用下的基因表达模式，确立特定毒性的基因表达谱，从而确定反应该类药物毒性的核酸类生物标志物，具有高通量、微型化和标准化的特点。Thukral等[6]选择氯化汞、2-溴乙胺氢溴酸盐、六氯丁二烯、丝裂霉素、两性霉素及嘌呤霉素研究了肾小管毒性作用基因表达的时效和量效关系，并根据差异表达的基因来预测其病理类型，结果显示，这种方法预测病理类型有100%的选择性和82%的灵敏度。Amin等[7]研究了顺铂、庆大霉素和嘌呤霉素等3种肾脏毒物对大鼠的肾毒性效应与基因表达谱的关系。以往认为嘌呤霉素特异性地损伤肾小球的足细胞，但该研究发现，嘌呤霉素却表现出与顺铂和庆大霉素诱导的肾小管毒性相似的基因表达模式，并得到了病理学方面的确认。因此，毒理基因组学技术有可能发现肾脏早期(给药后数小时)损伤的mRNA标志物，同时，这些来自典型肾毒性药物的候选生物标志物与传统毒性标志物的敏感性相当。基因表达分析再加上经典的终点分析，为揭示药物潜在的肾脏毒性机制提供了契机。Lǜhe等[8]发现，百草枯连续给药7 d后，大鼠的肾脏皮质有157个基因出现差异表达。这些基因的功能主要与氧化应激、脂质降解等有关，与已知的百草枯诱导的早期肾毒性反应是一致的[9]。并进一步表明毒理基因组学研究对中毒早期，甚至还没有出现形态学改变时毒性反应的预测能力。检测标志基因的表达情况以及突变亦可用于反映个体患肾脏疾病和肿瘤的易感性。Guay-Woodford[10]总结了已知的或可能有遗传因素的肾脏疾病以及20多种单基因肾脏疾病的易感基因。对易感基因的单核苷酸多态性分析有助于对有遗传因素的肾脏疾病作出更可靠的危险度评价，对鉴别那些接受特定化合物后可能发生肾毒性症状的高风险个体有重要意义。因此，毒理基因组学可从基因表达谱角度测定机体与药物相互作用后的整体变化，发现毒性生物标志物、进而开展毒性机制或毒性预测等研究，已在药物筛选、新药研发和临床合理用药等领域得到了广泛应用。

另外，微小RNA(miRNA)是一类进化上保守、长度为21～23 nt的内源性非编码单链小RNA，主要通过与其靶基因mRNA的3’非编码区结合来调节mRNA的稳定性或抑制其翻译，从而实现转录后调控。miRNA参与几乎所有类型的生物学途径，涉及多种疾病的发病机制，包括恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病；同时，也参与机体对药物的反应，包括药物治疗效果、药物毒性及预后诊断[11]。由于调控基因表达的miRNA在种属间高度保守，且在组织和体液中长时间贮存和反复冻融后不容易降解，稳定性较好，因此成为了核酸类肾毒性标志物研究的热点[12]。最早，Bhatt等[13]发现由p53诱导的miR-34a参与了顺铂引起的大鼠肾损伤。Szeto等[14]在慢性肾病患者尿液中发现miR-21和miR-216a的表达量与肾功能减退及肾衰竭病程发展有相关性，并认为尿液miRNA图谱具有成为生物标志物预测慢性肾病的潜力。Kanki等[15]发现，4个大鼠尿miRNA(let-7g-5p、miR-93-5P、miR-191a-5p和miR-192-5P)似乎与血清尿素氮和肌酐具有相似的敏感性，可能作为对顺铂引起的肾毒性检测的非侵入性生物标志物。Nassirpour等[16]利用二代测序miRNA表达谱平台检测尿液标本，确定miRNA let-7d、miR-203和miR-320可能作为药物诱导的肾小管上皮细胞损伤的新型尿液标志物。Saikumar等[17]研究探讨了miR-21、miR-155和miR-18a与心肌缺血/再灌注和庆大霉素治疗肾损伤的相关性，结果显示，上述3个miRNA在肾脏的表达上调，同时，miR-21和miR-155在血液和尿液样本的表达下调。miR-21和miR-155的增加与组织学损伤程度相对应，提示miR-21和miR-155可能在肾损伤的发生机制中起着重要作用，可作为肾毒性的潜在生物标志物。后续研究发现，miR-155缺失小鼠比野生型小鼠更容易产生顺铂导致的肾损伤[18]。Ramachandran等[19]检测了急性肾损伤患者尿液中整个miRNA组，以非急性肾损伤者为对照，确定4个miRNA，即miR-21(P=0.000 5)、miR-200c(P<0.000 1)、miR-423(P=0.001)、miR-4640(P=0.035 5)可能作为肾毒性的生物标志物。

3 代谢物类标志物

近年来，代谢组学作为一种新的系统生物学研究方法得到了飞速发展。其定义为对体液、组织、细胞等生物样本中相对分子量为1 000以下的所有小分子代谢物进行定性和定量分析，从而得到生物体受外界刺激后代谢水平的整体变化的结果。代谢组学揭示了在基因与环境共同作用下，个体生物体系功能状态的整体特征，关注各种代谢路径底物和产物的小分子代谢物，包括糖、脂质、氨基酸、维生素等，且信息量大，样本易得。代谢组学研究了多采用核磁共振、气相色谱-质谱联用(gas chromatograph/mass spectrometer，GC/MS)和液相色谱-质谱联用(liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS)等三种数据采集技术，结果显示，各有优缺点，可互为补充。代谢组学的发展和进步为食品、药品的安全性评价提供了新途径，为毒性标志物的发现提供了新的技术平台。

Hanna等[20]利用LC-MS分别测定注射0.9%氯化钠溶液、庆大霉素10 mg/kg、庆大霉素20 mg/kg后大鼠尿液，结合偏最小二乘法-判别分析(partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA)发现，庆大霉素使大鼠尿液中色氨酸含量显著增加。Zhao等[21]通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用和PLS-DA分析发现，马尿酸、硫酸吲哚酚、吡哆酸、山梨醇和N-乙酰葡萄糖是肾毒性的生物标示物。Li等[22]通过快速液相色谱-飞行时间质谱技术以及PLS-DA法，利用大鼠腹膜内或静脉注射顺铂诱导的肾损伤模型，发现影响肾毒性的生物标示物，溶血磷脂酰胆碱LPC(20 ∶3)、LPC(14 ∶0)、LPC(18 ∶3)、LPC(22 ∶5)、肌酸酐、花生四烯酸、脯氨酸和色氨酸可以作为其生物标示物。该小组还运用代谢组学评价了阿霉素的肾毒性，发现阿霉素可导致花生四烯酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、鞘脂类、甘油磷脂和胆汁酸的合成或代谢异常[23]。

Boudonck等[24]建立了庆大霉素、顺铂、妥布霉素诱导的大鼠肾损伤模型，以0.9%氯化钠注射液组为对照，针对给药1、5、28 d后的尿液标本和肾脏组织，利用LC-MS和GC/MS进行代谢组学分析，尿中的38种代谢产物和肾脏组织中的37种代谢产物被认为是早期肾损伤的候选标志代谢产物。尿中最早期标志物包括多胺、多种氨基酸、甘氨酰脯氨酸、葡萄糖胺、1,5-脱水葡萄糖醇、乙醇胺、和磷酸盐。肾脏组织中最早期标志物包括山梨醇、葡萄糖和5-甲基四氢叶酸盐。大部分标志代谢产物的变化趋势与损伤进程呈正相关，此种进展性标志代谢产物包括肾脏组织中的核苷，如2’-脱氧次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷，大部分氨基酸和二肽，以及尿液中的3’-羟基乙酸苯酯、N-乙酰神经氨酸盐、甘露糖、葡萄糖、肌醇、3-羟基丁酸、3-羟基-3-甲基戊二酸盐和马尿酸盐。当出现肾损伤时，大部分肾损伤的标志代谢产物均表现出含量升高，3-羟基苯乙酸和马尿酸表现出含量显著下降，另一个马尿酸相关代谢产物2-羟基马尿酸盐含量也表现出明显降低。

近年来，国内代谢组学技术在中药肾毒性作用机制及毒性标志物研究方面取得了较好的进展。Ma等[25]利用超高效液相色谱-质谱联用及主成分分析(principal component analysis，PCA)模型评价了牵牛子的乙醇提取物对大鼠的肾毒性，结果表明，血清中溶血磷脂酰胆碱的形成和神经鞘脂6的循环在一定程度上升高，但是苯丙氨酸的生物合成降低；尿液的分析结果显示，牵牛子乙醇提取物改变了氨基酸、柠檬酸、肌酐、胆酸、5-甲基四氢叶酸在尿液中的浓度[26]。Gu等[27]利用LC-MS代谢组学研究大鼠血清和尿液，发现马钱子使大鼠血清肌酐、尿酸水平明显升高，同时，尿中胍基丁二酸、胍乙酸、3-羟基吲哚硫酸盐和吲哚乙酸的水平也明显升高，表明氨基酸的代谢异常。Tan等[28]运用LC-MS技术分析附子的肾毒性，发现甜菜碱和磷脂酰胆碱可以作为其肾损伤的生物标示物。Lin等[29]通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用和PCA分析马兜铃酸的肾毒性，发现血浆中卵磷脂、脂肪酸、胆汁酸是马兜铃酸导致肾毒性的生物标示物。Chen等[30]在对马兜铃酸肾毒性进行的研究中，采用LC/MS技术及多变量统计分析(PCA和线性判别分析)，发现马兜铃酸导致大鼠在出现进行性肾损伤的同时，尿液代谢组也发生了显著的变化，内源性代谢物如亮氨酸、肌酸、肌酐、D-丝氨酸、同型半胱氨酸、5-CH3-四氢叶酸等的含量升高，而戊酸、辛酸、花生四烯酸、甲硫氨酸和氨甲酰磷酸等的含量则显著降低，提示同型半胱氨酸形成和叶酸循环加速，而同型半胱氨酸的再甲基化和花生四烯酸的生物合成减少。

以上研究结果显示，代谢组学分析涉及到的肾毒性生物标示物，包括三羧酸循环中间产物、脂肪酸代谢产物以及氨基酸代谢产物，可更全面地评价药物的毒副作用，从而实现对药物肾毒性的早期预测。但是，大部分研究集中于动物模型基础上的肾毒性生物标示物及相关药物肾毒性评价，而关于肾毒性标志物的临床应用以及毒性机制方面的报道较少，尚需对这些候选标志物进行临床验证，探讨药物毒性相关的代谢通路及与蛋白多肽类、核酸类标志物之间的相关性。

4 外泌体标志物

外泌体是由细胞内涵体分泌的小囊泡，广泛存在于任何体液中(包括唾液、血液、尿液、脑脊液等)，在细胞间信息传递中扮演着重要角色。外泌体主要由蛋白质、脂质、核酸(mRNA和miRNA)等组成，外泌体的组成与其细胞来源有关，并且与其来源细胞的生理功能或病理改变密切相关[31]。

Dear等[32]发现尿液中存在一种外泌体，其在肾脏上皮细胞内形成，最终释放到尿液中。尿液外泌体从肾单元各个部分分泌进入尿液，因此携带了预测肾脏结构和功能损伤的蛋白质和核酸类生物标志物，比如适合肾小球和肾小管损害的外泌体生物标志物，包括胎球蛋白A、Wilms瘤基因(WT1)、ATF3和NGAL蛋白等[33-34]。Lv等[35]研究结果表明，miR-29c、miR-200b和miR-200c的水平随慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)/肾纤维化程度加重而下调，是中、重度CKD/肾纤维化的候选标志物，其中miR-29c最佳。Lv等[36]的另一项研究结果表明，在CKD患者中，CD2相关蛋白的胞外体(CD2AP)mRNA水平下调，下调程度与疾病进展呈正相关。这些报道表明，尿外泌体miRNA/mRNA水平不仅可作为确定肾损伤的标志物，也可为CKD的进展提供标志。尿液外泌体分泌的miRNA因结构稳定、不易受尿液因素影响、变化出现早、可无创性获得等优点，可作为肾损伤的特异性生物标志物。随着分离外泌体方法的逐渐优化和蛋白质组学及毒理基因组学的发展，外泌体中更多的蛋白质和核酸将被发现和研究用于预测肾毒性。同时，由于外泌体膜与来源细胞的细胞膜具有同源性，故利用细胞膜上大量富集的蛋白进行免疫分选能提高诊断率。

尽管利用外泌体作为生物标志物具有诸多优势，但仍需要注意：(1)由于外泌体内容物含量较少，因此，有效内容物的富集度决定了外泌体作为生物标志物的可行性；(2)由于体液样本自身存在蛋白和RNA，因此，外泌体的分离和纯化尤为重要；(3)体液中各种类型细胞来源外泌体也会成为混杂因素，如正常体内提取的血浆外泌体可能来源于红细胞、淋巴细胞或血小板，而与血液循环直接或间接接触的组织细胞包括血管内皮细胞或有窗孔的组织包括胎盘、肝也可能将外泌体释放进入血液，因此，对外泌体来源细胞的筛选也非常关键[37]。

5 总结与展望

总之，随着高通量组学技术的不断成熟，反应基因组、蛋白组、脂质组和代谢组等不同层次的肾毒性生物标志物群涌现。同时，随着相应分析软件及系统生物信息学分析方法的不断成熟，网络信息资源的日益丰富和共享，早期肾毒性标志物及毒性机制将逐渐被揭示。

目前，肾毒性生物标志物的临床应用尚存在局限性：(1)不同药物的肾毒性针对不同的靶细胞(如肾小管上皮细胞、足细胞等)，并且均有轻-中-重度不断进展的过程。因此，肾毒性的分类、分级标准化需先期完成，在此基础上新的肾毒性生物标志物才能得到精准的确认和验证。(2)同类组学研究采用的技术手段及检测对象也亟需标准化，否则，所得数据存在的不一致性会给后期数据的整合分析带来一定困难。(3)绝大多数肾毒性标志物来源于动物模型和细胞水平的研究，动物模型的种属差异备受质疑，人原代细胞在体外不宜长期培养、来源不统一、个体差异大、不易实现标准化，因此，这些非临床研究来源的标志物是否能真实反映药物在人体内的肾脏毒性，尚需要大量的临床研究进行验证。

日本毒理基因组学项目致力于建立一个开放毒理基因组学项目基因组辅助毒性评价系统，免费提供170种化合物对应的基因表达数据和肾脏病理学数据，并提供相应的实验条件和操作程序(http：//toxico.nibio.go.jp/english/index.html)[38]。随着现代分子细胞生物学及形态学的发展，各类电镜、共聚焦技术突飞猛进，人们对细胞毒性机制的认识更加准确、全面，人源肾脏多细胞系体外共培养体系作为肾毒性标志物筛选的模型将跨越种属间差异障碍，生理药动学/药效学等新型预测模拟工具的应用将有效缩短临床验证的周期，并大大降低工作量，提高验证准确性。本课题组正致力于建立药物肾毒性早期预测的细胞模型及方法，通过生理药动学/药效学预测模型软件预测药物靶器官浓度，通过检测靶器官浓度下药物处理细胞后所致的细胞毒性、生物标志物水平的变化，从而预测药物的肾毒性，并验证毒性标志物早期预测药物肾毒性的可行性及特异性，为药物临床安全性评价提供实验依据。

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2017-03-07)

*副主任药师，医学博士。研究方向：临床药理学、临床毒理学。E-mail：haiyandu_az@126.com

#通信作者：主任药师，教授，医学博士。研究方向：临床药理学及心血管疾病等新药评价相关标志物验证。E-mail：linyang3623@163.com