维生素D及其代谢产物水平测定研究的进展Δ

耿春梅，江 沛，郭玉金

(济宁市第一人民医院临床药学科，山东 济宁 272011)

·本期特稿·

维生素D及其代谢产物水平测定研究的进展Δ

耿春梅*，江 沛，郭玉金#

(济宁市第一人民医院临床药学科，山东 济宁 272011)

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.04.001

维生素D是人体必需的营养素，血清维生素水平影响着人体内钙和磷的正常代谢，与心血管疾病、免疫系统疾病、糖尿病、肿瘤、神经系统疾病等密切相关，对人体健康发挥着重要作用。因此，维生素D水平的测量对诊断、治疗和预防维生素相关疾病有重要意义。25-羟基维生素D[25-(OH)D]不仅是维生素D在体内的主要表现形式也是评价体内维生素含量的重要指标。色谱分析法和免疫分析法等均可检测血清25-(OH)D水平，并根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价并在一定程度上给予补充治疗。现就常用的血清25-(OH)D质量浓度检测方法和维生素D补充进行综述。

1 维生素D及其代谢产物

维生素D是维持人类身体健康所必需的脂溶性维生素，但人体自身不能合成维生素D，阳光照射和食物摄取是人体维生素D的主要来源。维生素D2和维生素D3是维生素D的主要存在形式，必须在体内经过2次羟化才能发挥其生理作用。维生素D2和维生素D3经过血液循环进入肝脏，在肝脏25-羟化酶作用下转化为25-(OH)D2和25-(OH)D3，统称为25-(OH)D，25-(OH)D再经过肾脏25-(OH)D-1α羟化酶的催化转化成有生物活性的1,25-(OH)2D或24,25-(OH)2D[1-2]。1,25-(OH)2D被认为是最具生物活性的代谢物形式，24,25-(OH)2D通常被认为是25-(OH)D直接转化的的代谢物。24,25-(OH)2D和25-(OH)D都可作为体内维生素D状态的标记物。维生素D、25-(OH)D和1,25-(OH)2D在体内的半衰期分别为24 h、3周和4 h[3-4]。其中，25-(OH)D是血液中主要作用形式，其最稳定、浓度最高、半衰期最长，因此，人体血清25-(OH)D水平是衡量体内维生素D营养状况的最佳指标[5]。一般分别把血清25-(OH)D质量浓度<20、20～30、>30 ng/ml定义为维生素D缺乏、不足和充足[6]。

维生素D是机体内源性物质，在物质代谢中起调节作用。维生素D除了具有传统意义上的骨骼效应外[7]，25-(OH)D水平在心血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肥胖、神经精神系统疾病中也发挥着重要作用[8-10]。维生素D缺乏在全球人群中非常普遍，往往是摄入少和阳光暴露少造成的。维生素D缺乏和多种骨质疾病的发病直接相关，如儿童佝偻病以及成人的骨质疏松症等；同时，维生素D缺乏还会引发代谢性疾病和特殊恶性肿瘤[11-12]。因此，应建立可靠、灵敏、高效的维生素D水平检测方法，为临床上维生素相关疾病的诊断、预防和治疗提供一定的科学参考。

2 维生素D水平检测方法

目前维生素D水平的检测获得越来越多人的关注，很多医院和实验室把人体血清维生素D质量浓度检测作为一种常规检测，用于诊断和治疗维生素相关疾病。色谱测定方法和免疫测定方法是常用的两种分析方法。免疫分析法不能区分维生素D本身和类似物，只能测定25-(OH)D总量，无法同时测定25-(OH)D2和25-(OH)D3的质量浓度；色谱分析法包括液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[13-15]，能够区分25-(OH)D2和25-(OH)D3并测定其含量。

2.1 HPLC

HPLC具有较高的灵敏度、特异性和准确性，可以同时检测25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，与 LC-MS/MS测定结果的一致性良好。与免疫分析法比较，HPLC具有精确度高、分离效能高、分析速度快、重复性好、自动化高等优点。但HPLC的不足是设备较贵、检测通量小、样品前处理过程复杂、对操作人员要求较高等，目前临床上较少采用HPLC检测25-(OH)D水平。另外，HPLC虽能够同时检测25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，但其检测限达不到测定要求，无法测量低质量浓度25-(OH)D2。

2.2 LC-MS/MS

LC-MS/MS是应用最多的检测维生素D及其代谢产物水平的色谱法，样本经处理后采用液相色谱分离，检测器为质谱仪，在多反应离子监测扫描模式下，实现分子离子和碎片离子的质量选择，可同时检测到25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D和1,25-(OH)2D3，具有很高的灵敏度、特异性和准确性，被国际公认为检测维生素D水平的“金标准”检测方法。虽然LC-MS/MS在检测25-(OH)D水平方面具有明显优势，但样本需求量较大、样本前处理繁琐费时、仪器昂贵、仪器操作复杂、对 操作技术人员的要求较高，而且需要自己开发方法等，这在某种程度上限制了其的临床应用。Tai等[16]曾采用二氯甲烷-正己烷液液萃取提取法、LC-MS/MS法检测血清25-(OH)D2和25-(OH)D3样本，考察和评价其方法学。结果显示，LC-MS/MS能够将25-(OH)D2和25-(OH)D3分离并同其各自的同分异构体分离开，在信噪比约为3时，检测限约为0.15 ng/g。Assar等[17]采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定了25-(OH)D2、25-(OH)D3和24,25(OH)2D，血浆样品先用乙腈沉淀蛋白，然后采用固相萃取进行纯化，纯化的样品溶液进行衍生化并在超高效液相色谱仪上进样分析；流动相A为水(含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵)，流动相B为甲醇-水-乙腈(V∶V∶V=97 ∶2 ∶1，含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵)，以一定比例进行梯度洗脱，流速为0.35 ml/min，柱温为45 ℃；最低定量限为0.2 nmol/L。Ding等[18]采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定了血浆25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D3、 1,25-(OH)2D2和1,25-(OH)2D3含量，考察并验证了其方法学，结果显示，25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D3、1,25-(OH)2D3和1,25-(OH)2D2的线性范围分别为2.5～300.0、2.5～300.0、0.1～300.0、0.1～50.0和0.2～50.0 ng/ml，日内和日间精密度CV<10%，回收率为55%～85%。因此，LC-MS/MS作为“金标准”方法检测维生素D及其代谢产物，具有较好的准确度和精密度，可以用来与临床其他检测维生素D的方法作相关性比较。

2.3 免疫分析方法

免疫分析法包括放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光免疫测定法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)、电化学发光免疫测定法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、全自动生化分析法等，由于所有维生素D羟化物都能发生抗体抗原结合反应，因此，只能测定25-(OH)D总量，无法同时测定25-(OH)D2和25-(OH)D3的质量浓度。

RIA应用广泛，是最经典的测定机体内25-(OH)D水平的方法，操作简单、样品前处理简单。虽然RIA不可以同时检测出25-(OH)D2和25-(OH)D3，但是有研究结果证明RIA对血清25-(OH)D水平测定的结果与“金标准”LC-MS/MS测定结果的相关性好(R>0.90)[19]，适用于临床常规检测。

ELISA是早期维生素D水平测定的常用方法，其在自动化操作、节省人力、无污染等方面具有一定优势，适合常规临床实验室开展。但ELISA对基质敏感，容易发生交叉反应，导致方法特异性不足[20]。研究结果表明，ELISA对血清25-(OH)D水平测定的结果明显高于“金标准”LC-MS/MS[21]。ELISA作为大规模筛查维生素D缺乏及过量的方法，仍有一定优势，目前仍被广泛用于临床的体外诊断。

CLIA自动化程度高、操作简单、快速，但仪器昂贵、只能用于检测25-(OH)D总量。Frenzel等[22]比较了LIAISON CLIA测定25-(OH)D水平的结果分别与Dia RIA、LC-MS/MS的相关性，结果显示，CLIA与RIA测定结果的相关系数R=0.94，与LC-MS/MS测定结果的相关系数R=0.95。CLIA结果测定准确，适用于大样本维生素D含量水平监测。

ECLIA灵敏度高，干扰较少，可自动化批量操作。Van den Ouweland等[23]和Leino等[24]对比分析了罗氏E170型电化学发光免疫分析仪与LC-MS/MS检测25-(OH)D水平结果的一致性，发现ECLIA与LC-MS/MS检测结果的一致性较好。可见，ECLIA法测定维生素D的准确度、精密度、可重复性等均符合临床监测要求。

全自动生化分析法使用全自动生化仪，操作简便、测量迅速、准确度高、消耗试剂量小，在各级医院得到了广泛应用。全自动生化分析仪之间分析性能差异大，特异性差，日内和日间精密度不稳定，待测样品间易交叉污染[25]。宋爱华[26]评估了全自动生化法和CLIA方法测定25-(OH)D含量结果的相关性，相关系数R=0.994 1[27]，表明此方法可满足维生素D水平的测量，适用于各级医院临床常规监测维生素D水平。

3 维生素D补充

一项研究结果表明，高纬度地区人口更易伴随维生素D缺乏，因此，维生素D补充迫在眉睫，其可降低维生素相关疾病发生的风险，提高人们生活质量或延长人的寿命[28]。食物摄取或充足的阳光照射是北方地区传统上补充维生素D的最好方法。然而，高纬度地区人口维生素D合成障碍和食物摄取偏爱使维生素D补充具有一定难度，因此，鼓励其从多个来源进行维生素D的补充以保证人体最佳生理功能[29]。

维生素D补充剂量和如何补充，是个值得探讨的全民问题。美国医学研究所(institution of medicine，IOM)最近的建议(2011年起)只考虑到维生素D对骨骼健康和骨折复位的作用。IOM推荐1～70岁的人每日摄入维生素D 600 IU，年龄更大者摄入800 IU。成年人摄入维生素D的上限是4 000 IU/d。机体内维生素含量过高易造成血管和组织钙化。很多相关研究人员和健康组织不同意IOM推荐的维生素D日摄入量，认为每日应该摄入维生素D 800～2 000 IU，认为对于维生素D水平低的人而言，每日应该摄入维生素D 800～2 000 IU。血液中维生素D的质量浓度至少在30 ng/ml，也有人认为40或50 ng/ml更好。由于对维生素D测定标准及结果认同无统一标准，缅因州医疗中心研究所的Clifford Rosen和加利福尼亚大学的Janice M. Schwartz教授都推荐成年人应该每日摄入维生素D 800～1 000 IU。补充维生素D3是补充维生素的首选形式，在保持25-(OH)D水平方面，维生素D3的有效性约比维生素D2高50%～80%[30]。但是，还要根据不同个体的情况，个体化、合理补充维生素D。

综上所述，维生素D是人体不可缺少的营养物质之一，维生素D缺乏与机体代谢障碍及很多疾病的发生密切相关。人体内25-(OH)D的含量测定需求日益增大。目前，临床常用的方法有色谱法和免疫分析法，不同方法检测25-(OH)D水平的结果可能出现不同程度的差异，因此，在选择方法时，应根据灵敏度、特异性、测定费用、测定时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况综合考虑。更重要的是，可根据不同个体测得的血清25-(OH)D含量，做到科学、合理地补充维生素D，达到治病防病的目的。针对不同个体如何进行个体化维生素D补充是医药工作者面临的任务和挑战，个体化、合理补充才能让维生素D更好地为人们的健康服务。

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国家自然科学基金(No.81602846)

R977.2

A

1672-2124(2017)04-0433-03

2017-02-20)

*硕士研究生。研究方向：临床药理学。E-mail：gengchunmei8@126.com

#通信作者：副主任药师。研究方向：临床药理学。E-mail：gyj99@126.com