植物NRT1.1的研究进展及其在苎麻研究中的展望

侯美，喻春明

（中国农业科学院麻类研究所，长沙410205）

综述

植物NRT1.1的研究进展及其在苎麻研究中的展望

侯美，喻春明*

（中国农业科学院麻类研究所，长沙410205）

在自然条件下，硝酸盐是非固氮植物生长过程中从外界环境吸收的主要氮源。植物通过一系列硝酸盐转运蛋白实现对硝态氮的吸收与利用。NRT1.1（硝酸盐转运蛋白nitrate transporter1.1，NRT1.1）是植物根系吸收硝酸盐后第一个发挥作用的蛋白，其通过氨基酸序列中第101位苏氨酸是否发生磷酸化修饰而表现双亲和性转运功能；NRT1.1可作为一种信号分子，调控侧根的生长与发育；NRT1.1除了参与硝酸盐响应和转运过程，还参与植物对重金属的吸收。文章结合最新的研究报道，综述了植物硝酸盐转运蛋白NRT1.1的研究进展，并对其在苎麻研究中的作用进行展望，以期为提高苎麻氮同化效率与逆境抗性能力研究提供参考，并为苎麻育种提供理论依据与方向。

硝酸盐；NRT1.1；转运蛋白；信号分子；苎麻

氮是植物生长必需的大量元素之一，在自然条件下，硝酸盐是非固氮植物从外界吸收的主要氮源。此外，硝酸盐不仅作为植物生长所需的营养物质，还可以作为一种信号分子调节植物生长［1］。在打破种子休眠、调节叶片气孔运动、调控侧根发育和诱导相关基因表达等方面具有关键作用，另外，硝酸盐还可以影响植物开花周期［2］。植物根系通过膜蛋白对硝酸盐的吸收是植物获得氮素的第一个关键步骤［3］，由于植物固着生长的特性，在其进化过程中形成了复杂的硝酸盐转运系统来适应外界环境中硝酸盐浓度的变化［4］。拟南芥中的NRT1.1（nitrate transporter1.1）是高等植物中第一个被鉴定出的硝酸盐转运蛋白［5］，其在氮素积累和信号传导方面都具有重要作用；在小麦中发现经氮饥饿处理后TaNRT1.1表达受到显著抑制［6］；在水稻中发现NRT1.1B是一个高氮利用率基因，在育种中有着重要的应用价值［7］。另外，在白菜、茶树、菊花等作物中成功克隆出NRT1.1基因，并对其进行功能鉴定［8－10］。NRT1.1是一个双亲和转运蛋白，在不同的硝酸盐浓度下，都可对其进行转运［11］。NRT1.1可作为一种信号分子，调控NO－3信号响应过程［12－13］；NRT1.1除了参与硝酸盐吸收和转运过程，还参与到植物对逆境胁迫的响应［14］。

1 植物体中的硝酸盐转运蛋白

植物中有NRT1和NRT2两个硝酸盐转运蛋白（nitrate transporter，NRT）基因家族［15］。其中NRT1转运蛋白属于PTR（peptide transporters）家族成员，PTR家族是一类可转运氨基酸、寡肽和NO－3等含氮化合物的膜转运蛋白。到目前为止，在拟南芥中，经鉴定有8个PTR家族蛋白（NAXT1，NRT1.1，1.2，and 1.4-8）具有硝酸盐转运蛋白功能［16－20］，这些蛋白在硝酸盐转运过程中各自发挥着独特的作用。NRT1.1和NRT1.2在根部吸收硝酸盐［21－23］，NAXT1（nitrate excretion transporter1）在硝酸盐流出到外部介质中发挥重要作用［24］，NRT1.4将NO－3转运到叶柄中［25］，NRT1.5和NRT1.8分别在根木质部和根中柱中装载和卸载硝酸盐［19，26］，NRT1.6将硝酸盐转运到胚胎中［18］，NRT1.7将硝酸盐转运到韧皮部［20］。目前拟南芥中已发现的NRT1转运体共有53个［27］。

NRT2转运蛋白属于NNP（nitrate－nitrite－porter）家族成员，是MFS超家族（major facilitator superfamily）之一［28］。1996年，在大麦（Hordeum vulgare）中第一次分离得到高等植物的NRT2基因HvNRT2．1和HvNRT2．2［29］；2001年，利用T－DNA插入突变体分离得到了拟南芥高亲和性硝酸盐转运蛋白AtNRT2.1［30］。进一步研究表明AtNRT2.1定位在根系质膜，是主要的高亲和硝酸盐转运蛋白［30－32］。在拟南芥中发现NRT2家族中共有7个成员，半定量PCR试验表明，AtNRT2．1、At-NRT2．4、AtNRT2．5和AtNRT2．6主要在根中表达，AtNRT2．7主要在地上部表达［33］。所有的NRT2家族成员都在硝酸盐浓度较低时发挥作用，且硝酸盐是其作用的唯一底物［34］。

2 植物NRT1.1对硝酸盐的作用

2.1 植物对硝酸盐吸收利用的机制

植物对硝酸盐的吸收和分配在氮的有效利用上起着关键作用［35］。根系对硝酸盐的吸收是硝酸盐发挥功能的第一步，根系吸收NO－3主要依赖其主动吸收系统［36］。负责转运NO－3的载体称为硝酸盐转运蛋白（nitrate transporter，NRT）［37］，硝酸盐转运蛋白属于膜转运蛋白MFS家族，参与并介导植物根系对NO－3的吸收与转运［16］。为了适应外界硝酸盐浓度的变化，植物在进化过程中形成了对NO－3亲和力不同的转运系统，根据对其亲和力的不同，NO－3吸收系统分为高亲和力转运系统（High－affinity nitrate transport system，HATS）和低亲和力转运系统（Low－affinity nitrate transport system，LATS）［1，35］，其中高亲和力转运系统根据其功能的不同可以进一步分成组成型高亲和力转运系统（constitutive HATS，cHATS）和诱导性高亲和力转运系统（inducible HATS，iHATS）。当硝酸盐浓度高于1 mmol／L时，低亲和力转运系统优先起作用；低于1 mmol／L时，高亲和力转运系统发挥主导作用［38］，与两个硝酸盐转运系统对应的两个家族基因NRT1和NRT2已经得到确认，它们分别编码硝酸盐的低亲和力和高亲和力转运系统。现在的研究普遍认为与低亲和吸收系统相对应的是NRT1家族，而与高亲和吸收系统相对应的是NRT2家族［39］。随着分子生物学研究技术和生物信息学的发展，很多参与硝酸盐转运的基因已经被相继分离、克隆出来，并对其功能进行了较为深入的鉴定［35］。其中拟南芥硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1.1是第一个被分离、克隆出来的硝酸盐转运蛋白基因［5，40］，AtNRT1.1蛋白是目前在植物中研究最为清楚的硝酸盐转运体［41］。

2.2 NRT1.1在植物吸收利用硝酸盐过程中的作用

NRT1．1基因于1978年第一次在拟南芥中被分离出来［40］。1993年，Tsay等［5］用T－DNA插入突变体中发现其（CHL1）具有转运硝酸盐的功能。2004年，通过转录组分析，在拟南芥突变体中发现NRT1.1具有信号功能［42］。NRT1.1在低硝酸盐浓度下影响侧根原基的成熟与伸长，并且在不同的硝酸盐浓度下，NRT1.1影响初级根起始阶段的生长［43］，NRT1.1主要在根部表达［44］，其表达量与pH高低［21］或是否存在生长素有关［45］。NRT1.1是一种硝酸盐转运蛋白，也是一种硝酸盐传感器，可调控植物对硝酸盐的初级响应过程，并且证明NRT1.1对硝酸盐的转运功能与信号传感功能是相互独立的［12］。近年来发现其也可以在叶片的保卫细胞中表达［46］。

最新研究［47］发现，水稻OsNRT1．1基因有两种不同的拼接产物OsNRT1.1a和OsNRT1.1b，在以硝酸盐为氮源的情况下，高浓度时它们超表达植株都能引起植株中氮素的累积并增加地上部干物质重量，同时发现OsNRT1.1b蛋白比OsNRT1.1a蛋白具有更高的氮素亲和性。经序列分析后发现籼稻与粳稻中OsNRT1.1B蛋白发生了单核苷酸多肽性，粳稻中的Thr327残基在籼稻中变成了Met327，这导致籼稻比粳稻具有更高的氮素利用效率［48］。由此可知，OsNRT1．1B基因序列的变化是造成粳稻和籼稻对硝态氮利用差异的原因。

2.3 NRT1.1对硝酸盐的双亲和性转运

目前拟南芥中已发现的NRT1转运体有53个［27］。其中，拟南芥AtNRT1.1和苜蓿MtNRT1.3是双亲和性转运体，在低浓度下具有高亲和性，高浓度下具有低亲和性，而其它都是低亲和性转运体［34，49－50］。研究表明，NRT1.1通过Thr101残基是否被磷酸化，实现NRT1.1在高亲和性和低亲和性功能之间的转换，此苏氨酸发生磷酸化修饰受外界NO－3浓度诱导的转录调控［12］，并且在爪膽卵母细胞中发现，当NRT1.1中Thr101残基被磷酸化，其变为高亲和性转运体，此时Km值约为50μmol／L；而当Thr101去磷酸化后变为低亲和性转运体，其Km值约为4 mmol／L［51］。由于NRT1.1对硝酸盐的转运具有双亲和性，因此无论外界硝酸盐浓度高还是低，NRT1.1都可对其进行吸收转运。

最近，在NRT1.1晶体结构中发现了NRT1.1是如何通过氨基酸序列中第101位苏氨酸发生磷酸化修饰而表现双亲和转运功能的。NRT1.1晶体由两个非常相似的不对称分子构成［51－52］，具有12个跨膜结构，N端具有6个（TM1－TM6），C端具有6个（TM7－TM12）［53－54］。体外生化研究和细胞基荧光共振能量转移（FRET）试验表明，NRT1.1的双亲和转运功能与晶体二聚体结构有关［55］。另外，NRT1.1磷酸化修饰影响NRT1.1低聚状态，关键残基Thr101位于二聚体右侧相邻的疏水区域，预测是由于其附近的静电和构象变化，引起Thr101磷酸化，从而干扰二聚体的构象。相关研究［51］表明，磷酸化依赖NRT1.1的二聚化“摇臂开关”实现双亲和转运功能：未干扰的NRT1.1结构耦合的二聚体表现低亲和力的转运功能，而磷酸化的NRT1.1使二聚体解耦，表现高亲和力的转运功能。NRT1.1通过二聚体是否解耦实现低亲和力与高亲和力转运功能之间的转化，当硝酸盐浓度较高时，NRT1.1去磷酸化，具有二聚体结构，灵活性较低，执行低亲和力转运功能；硝酸盐浓度较低时，NRT1.1磷酸化，二聚体结构被干扰，灵活性较高，执行高亲和力转运功能［56］。

3 NRT1.1在植物中对NO－3信号响应的调控

3.1 NRT1.1的底物识别特点

NRT1.1的大多底物结合位点是疏水的，除了位于第7个跨膜结构上的His356，这对NRT1.1识别硝酸盐是至关重要的，而His356在NRT1／PTR家族中并不保守，这揭示了NRT1／PTR家族中的其它成员具有除硝酸盐外的不同底物识别机制，因此结合位点的序列差异导致NRT／PTR的不同成员识别不同的底物［55］。

3.2 NRT1.1调控NO－3对NRT2.1的诱导表达

首次发现NRT1.1具有信号功能是在chl1突变体中，同时发现该突变体中NRT2.1基因的表达受到明显的抑制［13，42］。NRT2.1在植物根中表达，编码高亲和转运系统的重要组分［30，32，57］，其表达受NO－3的诱导，并且在高N情况下其表达受抑制［58－59］，研究发现［42］NRT1.1突变体阻止了NRT2.1在高氮条件下的抑制表达。而NRT2.1并不是受NRT1.1调控的唯一基因，在拟南芥chl1突变体中发现，NO－3诱导的100多个基因表达受损［60］，其中包括NIA1，NiR和CIPK8［12］等，因此NRT1.1参与NO－3信号响应的多个过程。

3.3 NRT1.1对生长素的调控作用

生长素是植物生长所需的重要植物激素，调控植物生长和发育，如促进侧根形成、器官衰老、维管束组织的形成和分化发育、顶端优势以及植物的向地和向光反应等［61－63］。在根中，NRT1.1蛋白可作为一种信号分子，调控生长素在侧根中的积累，当NO－3较低时，NRT1.1促进生长素的向基运输，使侧根中生长素浓度降低，抑制侧根生长；NO－3浓度增加时，NRT1.1抑制生长素的向基运输，使侧根中生长素浓度增加，促进侧根生长［64］，因此，在一定范围内，当硝酸盐浓度较低时（≦0.2 mmol／L），抑制侧根生长；较高时（1 mmol／L），促进侧根生长，这是通过调节NRT1.1参与的ANR1基因表达的信号途径来完成［65］。也有假设认为，NRT1.1既可以转运硝酸盐也可以转运生长素［66－67］，但是并没有发现这两种物质的结构相似性。而在油菜中发现，与NRT1.1同源性很高的NRT1.2在非洲爪蟾卵母细胞中既可以转运NO－3，又可以转运氨基酸［68］，故NRT1.1究竟能否直接转运生长素还有待于进一步研究证明。此外还有研究［69］表明，生长素可促进拟南芥AtNRT1.1基因表达，从而增强硝酸盐吸收。

3.4 NRT1.1与谷氨酸的相互作用

对于NO－3，谷氨酸（L－glutamate）可作为一种信号分子调控植物根系结构［70］，研究［71］表明，NRT1.1通过与谷氨酸的相互作用调控植物的根系结构，在拟南芥中，谷氨酸抑制初生根的生长，促进根形成分枝，正常情况下，在培养基中加入过量的谷氨酸会抑制这些作用，但在缺失NRT1.1的突变体中却未发现这种现象。因此，在拟南芥中NRT1.1作为一种信号分子，调控NO－3逆转谷氨酸抑制主根伸长的过程［70－71］。

4 NRT1.1参与植物对重金属的吸收

为了适应不良环境，植物在进化过程中形成了相应的抗性机制，在蛋白及相关基因的表达方面发生相应的变化，进而激活保护代谢途径，维持植物正常的生长发育［72］，研究［73］发现植物的抗性与细胞生物膜系统的逆境蛋白关系密切。

重金属污染是当今面积最广、危害最大的环境问题之一，而镉是金属元素中毒性最强的元素之一，会对动植物产生较大的毒害作用［74］。科学家对于植物的耐镉机制进行了大量的研究，旨在提高植物的耐镉性，并改善当前由镉及其它重金属造成的污染现状。

研究［14］发现，NRT1.1除了参与硝酸盐响应和转运过程，还参与到植物对逆境的响应。研究［75］发现，与铵态氮为氮源相比，硝态氮为氮源的向日葵根中积累更多的Cd，重金属离子会影响植株的氮同化过程，进而影响植株的氮素利用率，例如铅能通过抑制根部生长来影响植物对氮素的吸收。Cd能抑制硝酸盐的吸收、转运和同化，导致生物量和蛋白含量的减少［76］。有研究［42］表明突变体（chl1．5）对NO－3具有较低的吸收能力，并抑制AtIRT基因的表达，IRT能够转运Fe2＋、Cd2＋等二价阳离子，因此推测可能是NRT1.1调控二价金属离子的吸收。另外，毛倩倩等［77］研究表明，与NH＋4相比，NO－3能促进拟南芥根部对Cd的吸收；镉胁迫下，拟南芥根部硝酸盐含量和吸收速率下降，Cd抑制NO－3吸收的关键原因是NRT1.1活性被抑制，NRT1.1通过离子平衡调控Cd吸收。

5 NRT1.1在苎麻研究中的展望

苎麻（Boehmeria nivea L.Gauld）是多年生宿根草本植物，有“中国草”之称［78］，其蛋白质含量高，营养丰富，生物产量大，再生能力强，是很好的饲用植物蛋白质来源［79］。氮素作为苎麻正常生长发育过程中不可缺少的元素之一，是其体内蛋白质及叶绿素的主要成分，合理利用氮素能促进苎麻茎和叶片的生长，提高生物产量和经济效益［80］。苎麻作为南方重要的经济作物之一，如何提高其氮素利用率一直是苎麻育种工作的研究重点。NRT1.1在植物对硝酸盐的吸收与利用过程中具有非常重要的作用，明确其作用机制，可能有助于提高苎麻的氮素利用率。目前在拟南芥、水稻、小麦等作物中对于NRT1.1在硝酸盐吸收利用过程以及植物生长发育中的研究已经有了重要的进展，而在苎麻中尚未见研究报道。

近年来，在苎麻育种方面，与氮素利用相关的研究成为热点，其主要通过氮高效品种筛选提高苎麻对氮素的利用效率，至于苎麻的氮高效分子机制还在初步探索中。苎麻是多年生作物，其品种选育所需周期较长，工作量大，易受环境条件影响，如何快速高效地提高苎麻的氮素利用率是苎麻育种工作中亟需解决的问题。另外，苎麻根系发达，具有较强的耐镉吸附性，目前虽进行了大量与苎麻吸附重金属镉有关的研究，但与其分子机制有关的研究较少。NRT1.1可作为一种信号分子参与植物对逆境的响应，苎麻NRT1.1的重金属吸收机制与其它作物相比具有怎样的异同点及优势，是苎麻作物研究中亟需明确的问题。鉴于此，今后NRT1.1在苎麻作物中可进行以下相关研究。

5.1 进行苎麻NRT1.1基因的克隆与功能验证

目前NRT1.1基因在拟南芥、水稻等作物中已相继被克隆出来，并进行了功能验证，在苎麻作物中还没有相关研究。可通过苎麻NRT1.1基因的克隆与功能验证，明确苎麻NRT1.1在硝酸盐吸收利用过程中的作用，并试图通过分子生物学手段提高苎麻的氮素利用率。同时还应通过生物信息学分析，明确苎麻NRT1.1基因与其它作物中已经克隆出来的NRT1.1基因的异同之处，并尝试将其它作物中利用NRT1.1提高氮素利用率的方法借鉴到苎麻作物中，例如水稻利用单核苷酸多态性提高其氮素利用率。

5.2 探索NRT1.1与苎麻根系结构的关系

苎麻具有较复杂的根系结构，其由营养根（俗称萝卜根）、支根和细根组成［81］，并且苎麻根系具有较高的医疗保健和药用开发价值［82］。NRT1.1可调控植物的根系结构，因此，可尝试通过NRT1.1调控苎麻的根系结构，提高苎麻的医药价值与经济效益。

5.3 研究硝酸盐对苎麻氮素利用率的影响

目前在苎麻对氮素利用方面进行了大量研究，但是对于氮源形态对苎麻生长的影响还未见相关报道。在其它作物中发现NRT1.1对硝酸盐具有双亲和性转运功能，今后可侧重研究不同形态的氮源对苎麻NRT1.1的基因表达及苎麻氮素利用率的影响，并提高苎麻对硝态氮的利用率，从而提高苎麻的氮素利用率。

5.4 提高苎麻对镉的吸附性

苎麻具有较强的耐Cd性［83］，NRT1.1参与到植物对逆境的响应，如Cd胁迫［14］，但是NRT1.1对苎麻的耐镉机理是否具有调控作用尚不清楚，应加强相关方面研究，试图通过NRT1.1促进苎麻对硝酸盐的吸收转运，提高苎麻对镉的吸附性，用于有效治理当前的Cd污染。

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Research Progress of NRT1．1 in Plant and its Prospect in Ram ie Research

HOU Mei，YU Chunming*
（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

Under natural conditions，nitrate is themajor nitrogen sources absorbed from the outside in non－nitrogen fixing plants.Plants uptake and utilize nitrate through a series of nitrate transporters，and nitrate transporter 1.1（NRT1.1）is the first protein to play a role in roots after they absorb nitrate. It is shown that the phosphorylation of Thr101 in the amino acid sequence displays the dual－affinity nitrate transporter of NRT1.1.NRT1.1 also can be used as a signalmolecule regulating the growth and development of lateral root.NRT1.1 is notonly involved in responding to nitrate and transporting it，butalso involved in responding to abiotic stress.According to the latest research reports，the paper summarized the research progress of nitrate transporter NRT1.1 in plant and described its prospect in ramie research in order to provide reference for the study of nitrogen assimilation efficiency of ramie and improve ramie stress resistance ability.In addition，it is aimed to provide a theoretical basis and direction for Ramie Breeding.

nitrate；NRT1.1；transport；signal；ramie

S563.1

A

1671－3532（2017）04－0207－08

2017－03－07

国家麻类产业技术体系（CARS－19－E02）；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP－IBFC05）

侯美（1990－），女，在读硕士，主要从事作物遗传育种研究。E－mail：qyhoumei＠163.com

*通讯作者：喻春明（1964－），男，研究员，主要从事苎麻遗传育种研究。E－mail：nxycm＠163.com