组织蛋白酶S与恶性肿瘤

张智郭鹏肖艺孙兴徐静彭涛吴曙粤黄海

作者单位：530022 南宁1南宁市第一人民医院肝胆腺体外科；530021 南宁2广西医科大学第一附属医院肝胆外科；530022 南宁3南宁市第一人民医院儿科；530021 南宁4广西医科大学附属口腔医院口腔外科

综述

组织蛋白酶S与恶性肿瘤

张智1郭鹏4肖艺1孙兴1徐静2彭涛2吴曙粤3黄海1

作者单位：530022 南宁1南宁市第一人民医院肝胆腺体外科；530021 南宁2广西医科大学第一附属医院肝胆外科；530022 南宁3南宁市第一人民医院儿科；530021 南宁4广西医科大学附属口腔医院口腔外科

组织蛋白酶S（Cathepsin S，Cat S）是一种半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族成员之一，不仅在多种生物体中表达，而且参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生过程。近年研究发现，Cat S与肝癌、肺癌、乳腺癌和结直肠癌等多种肿瘤的发生发展、侵袭转移以及预后等密切相关，推测其有望成为多种肿瘤临床诊治的新靶点。本文就Cat S与这些肿瘤的发生发展关系、调控分子机制、诊断和治疗等相关研究进展作一综述。

肿瘤；组织蛋白酶S；诊断；治疗

恶性肿瘤的发生率及病死率较高，严重危害人类健康，因此，探索新的、特异性的肿瘤预后标志物是目前临床研究的热点。组织蛋白酶（Cathepsin）属于木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶，参与编码人类基因组2.8%的蛋白，同时还参与细胞内异常蛋白质的降解［1］，调控细胞内信号通路、受体活性及趋化因子、细胞因子的活性［2］。研究表明组织蛋白酶和阿尔茨海默病、哮喘、肺纤维化、癌症等疾病发生发展密切相关［3-5］。

人类组织蛋白酶包括十五名成员，根据活性位点分为三组：（1）丝氨酸（Cat A和G）；（2）天门冬氨酸（Cat D和E）；（3）半胱氨酸蛋白酶（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）。此外，半胱氨酸组织蛋白酶还可以根据蛋白水解活性分成以下两组：（1）主要表达内切肽酶活性的Cat S、K、V、F和L；（2）同时表达内切和外切肽酶活性的Cat B、H、X和C［6］。研究表明，Cat S是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成员，主要在淋巴结抗原呈递细胞、脾脏和其他免疫细胞中表达，参与细胞外基质、抗血管生成肽和黏附蛋白的降解，促进新生血管形成和肿瘤细胞侵袭转移［7］。

近年研究显示，Cat S在肝癌、肺癌、乳腺癌和结直肠癌等多种肿瘤中呈高表达，与这些肿瘤的生物学特性及发生发展、侵袭转移密切相关，本文就Cat S与这些肿瘤关系的相关研究进展作一综述。

1 Cat S的基因结构与肿瘤血管形成的相关机制

Kregar等［8］和Turnsek等［9］首次将Cat S从牛淋巴组织（1975年）和脾脏（1980年）中分离纯化出来，并且命名为Cathepsin S。1992年Shi等［10］通过PCR技术首次从人肺泡巨噬细胞中提取了人类Cat S基因的cDNA，并且证实其与牛Cat S基因cDNA碱基序列有85%高度相似性，并因此而命名。Cat S属半胱氨酸蛋白水解酶，分子质量为24 kDa。1998年，McGrath等［11］通过X线技术证实了其晶体结构图。Cat S通常分布在淋巴结、脾脏、心脏及抗原提呈细胞，分别与Cat L、Cat H、Cat B有57%、41%、31%的序列同源性［10］。研究证明肿瘤细胞可将Cat S从溶酶体分泌到肿瘤微环境中［12］，在中性pH环境下参与细胞外蛋白水解作用［13］。

人类Cat S属于单基因表达产物，其基因定位于人染色体I q21，包含5个外显子和5个内含子，上游调控序列包含SP I结合位点2个，API结合位点18个，GC含量占40%，但不包含TATA或CMT盒子［14］。具有酶活性的Cat S为单链蛋白，由331个氨基酸组成，含一个信号域，包含3个a螺旋，分别位于氨基酸位点25～40、50～56及68～78；另外还含有一个前肽域，包括6个0折叠片及一个a螺旋。两个结构域之间形成具有催化活性的狭长裂隙，由25～40位点的a螺旋、157～161及130～133位点的0折叠片构成，含有S1、S2、S3 3个底物结合口袋，内含具有催化活性的Cys25、Hisl59及Asnl75三联子，可以与底物相结合，发挥生物学活性［11］。

目前关于Cat S生物学功能的研究主要集中在以下两个方面：（1）通过调节MHCCII抗原递呈，诱导免疫调节；（2）诱导新生血管形成，促进肿瘤侵袭转移［15］。本文重点综述Cat S诱导肿瘤血管形成促进肿瘤侵袭转移的机制。

研究表明，Cat S影响肿瘤血管生成包括以下两方面：（1）参与细胞外基质酶的降解。Cat S的底物广泛，其对高弹性蛋白水解活性的降解成为研究的热点。Cat S的底物-细胞外弹力蛋白与新生血管形成、肿瘤发生发展密切相关［16］。Cat S的退化产物促进了新生血管形成，弹力蛋白-肿瘤细胞相互作用促进肿瘤发生发展。研究发现，Cat S可与MMPs、丝氨酸蛋白酶等相互作用，参与细胞外基质的降解［17］。有学者［18-19］通过低密度脂蛋白受体和Cat S双阴性的小鼠动物模型发现动脉斑块形成和弹力层碎片减少，这提示Cat S参与了细胞外弹性蛋白的降解。此外，肿瘤发生发展过程中诱导产生VEGF、bFGF等血管生成因子作用于内皮细胞，诱导内皮细胞活化，进一步诱导Cat S分泌，参与基底膜和周围的细胞外基质降解，促进肿瘤侵袭和转移［20］。（2）抑制抗血管生成肽的分泌。Shi等［21］通过培养内皮细胞，加入VEGF血管生成因子，通过ELSA实验检测细胞培养基发现VEGF可促进Cat S的表达，而Cat S抑制剂Cystatin C可明显抑制血管的生成。恰当的基质降解是内皮细胞迁移和毛细血管形成所必需的，同时可以诱导血管新生物质如碱性成纤维细胞生长因子的分泌，使他们具有血管新生活性从而诱导肿瘤新生血管形成。Wang等［22］通过构建Cat S阴性的胰岛细胞瘤裸鼠模型，发现沉默Cat S基因后可明显抑制肿瘤新生血管形成，抑制肿瘤生长。其可能的分子机制是Cat S刺激层黏连蛋白产生血管生成前体γ2碎片，并且抑制IV型胶原来源的抗血管生成肽增殖，从而促进血管生成。Burden等［23］研究发现靶向Cat S的单克隆抗体Fsn0503可以显著抑制结肠癌HCT116细胞外Cat S对蛋白的水解作用，抑制血管内皮细胞的增殖、肿瘤和新生血管形成。以上研究结果均提示Cat S在诱导血管生成，促进肿瘤侵袭转移中起重要作用。

2 Cat S与恶性肿瘤

越来越多的证据表明，Cat S通过促进细胞外基质（层黏连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白）的降解，参与VEGF等生长因子分泌而促进新生血管形成，从而促进肿瘤侵袭和转移［24-26］。Cat S与多种肿瘤的发生、发展和转归密切相关，其在组织和血清中的含量对肿瘤诊疗等方面可能具有重要的临床应用价值，已成为目前研究的热点之一。

2.1 Cat S与肺癌

研究发现，CL1-5细胞过表达Cat S基因，沉默Cat S基因可以明显抑制肺癌侵袭和转移，此外过氧化氢（H202）可明显抑制细胞克隆形成并且呈时间（50μmol H2O2作用0.5 h、1 h、2 h、4 h和6 h）和剂量依赖性（2.5～50μmol H2O2分别作用24 h）［27］。Kos等［28］选择73例肺癌患者（62例原发性非小细胞肺癌、11例转移性肺癌），通过W estern blot分析Cat S的表达，结果发现，肺癌组织Cat S的表达是正常肺组织的2倍，更为重要的是原发性肺癌组织Cat S的表达量高于继发性肺癌组织（P=0.01）；Cat S表达和肺癌TNM分期无关，但与生存率呈正相关。由此推测Cat S在肺癌组织中的表达有望作为一个独立预测因子，成为肺癌治疗和评估预后的指标。

2.2 Cat S与结直肠癌

Small等［29］通过RNA干扰技术沉默结直肠癌MC38细胞的Cat S基因，结果发现可明显抑制其侵袭（62%，P=0.0001），同时伴随金属蛋白酶2（matrix metallo proteinase 2，MMP2）和MMP9蛋白的下降，提示Cat S可能通过调控MMP2和MMP9参与结直肠癌的发生。Vazquez等［16］通过MTT实验分析表明，靶向Cat S的单克隆抗体FSN0503h可明显抑制人结直肠癌Colo-205细胞增殖（P＜0.05），进一步提示Cat S与结直肠癌的发生发展密切相关，认为可将CatS作为结直肠癌治疗的重要靶向蛋白，为结直肠癌治疗提供新的策略。

2.3 Cat S与前列腺癌

Lindah l等［30］通过Western blot实验检测9例前列腺癌根治性手术的标本，结果发现，和正常组织相比，前列腺癌组织标本Cat S表达明显增高（P=0.023），提示Cat S在前列腺癌发生发展中发挥了重要作用。

2.4 Cat S与乳腺癌

研究表明慢性炎症与肿瘤发生关系密切［31］。Basu等［32］利用RT-PCR技术分析69例乳腺癌患者和719例正常人外周血的超敏C-反应蛋白（high-sensitivity C-reaction protein，hsCRP）与Cat S的表达水平，结果发现Cat S和hsCRP表达同时增高的人群乳腺癌发生的风险（OR=0.46；95%CI=0.23～0.92；P=0.02）低于仅hsCRP增高的人群（OR=2.01；95%CI=1.02～3.95；P=0.04），提示Cat S和hsCRP关系密切，但相关机制尚未进一步验证。

2.5 Cat S与胃癌

Liu等［33］通过ELISA实验检测119例胃癌患者和99例正常人外周血Cat S的表达，结果发现，和正常人相比胃癌患者Cat S的表达明显增高（P＜0.001），术后比术前明显下降（P＜0.001），利用免疫组化和Western blot实验进一步验证胃癌组织和SGC7091、MGC803、AGS胃癌细胞也得出相同的结论。作者还发现，在胃癌组织中，Cat S的表达水平与年龄、性别、吸烟、饮酒无关，而与TNM分期、淋巴结转移和临床分期密切相关（P＜0.001）。通过Kaplan-Meier分析患者5年生存率，结果发现Cat S的表达和患者生存期呈负相关，检测的敏感性为60.7%，特异性为90.0%。由此表明，检测胃癌组织中Cat S的表达可作为胃癌治疗和评估预后的有用指标。

2.6 Cat S与星形细胞瘤

Zhang等［34］通过Cat S抑制剂ZFL（24 h IC50：U251 mg，18.68μmol；U87mg，23.10μmol）作用于人星形胶质瘤细胞（U251 mg和U87mg），流式细胞仪检查显示：抑制剂ZFL通过自噬诱导U251 mg和U87 mg细胞凋亡，并且呈时间和剂量依赖性，进一步通过Western blot实验分析发现，ZFL可抑制星形胶质瘤细胞Cat S、p-AKT、mTOR和p70S6K蛋白的表达，提示抑制剂ZFL通过阻断PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路抑制Cat S表达，进而诱导U251 mg和U87 mg细胞凋亡。Flannery等［35］通过PCR实验发现星形细胞瘤Cat S的mRNA表达水平明显增高，通过免疫组化实验检测了31例脑星形细胞瘤（I级5例、Ⅱ级10例、Ⅲ级5例、Ⅳ级11例）Cat S的表达，结果发现其和肿瘤分级呈正相关。进一步通过细胞侵袭实验发现，Cat S抑制剂LHVS29可明显抑制星形胶质细胞侵袭，并且呈浓度依赖关系（10 nmol/L和50 nmol/L的LHVS29抑制率分别为49%和61%（P＜0.0001），这提示Cat S可作为预测星形细胞瘤预后的指标。

2.7 Cat S与肝癌

Xu等［36］通过免疫组化实验检测63例肝癌组织标本（男性58例，女性5例，平均年龄45岁），结果提示，和正常肝组织相比，肝癌组织Cat S表达增高1.8倍，与Child分级呈正相关。Fan等［37］通过RNA干扰技术沉默MHCC97-H肝癌细胞CatS基因的表达，结果可抑制细胞侵袭、迁移和人脐静脉细胞小管形成。Wang等［38］通过慢病毒沉默MHCC97-H肝癌细胞Cat S基因的表达，流式细胞仪检测发现,和正常肝癌细胞相比，沉默Cat S基因后可抑制细胞凋亡（30.07%vs 18.58%）；Western blot实验发现沉默Cat S基因后可诱导NF-κB蛋白的表达。Lee等［39］通过免疫组化检测42例肝癌组织标本，结果发现CatS的表达和CD47呈正相关。此外作者通过RNA干扰技术沉默Huh-7肝癌细胞Cat S基因表达后可上调NF-κB蛋白的表达，进而诱导细胞凋亡。Zhang等［40］通过体内外实验发现蜂毒素可调控CatS诱导肝癌血管生成。作者通过稳定转染pcDNA3.1-shRNA-Cat S质粒，有效沉默肝癌MHCC97-H细胞Cat S基因表达，结果提示，和沉默Cat S基因组比较，4μg/mL和8μg/mL蜂毒素作用下可抑制正常MHCC97-H细胞组细胞克隆形成［（36.1±8.7）%vs（6.5±8.9）%，P＜0.05］、细胞迁移［（22.5± 2.1）%vs（1.5±1.9）%，P＜0.05］和细胞侵袭［（42.9±3.9）% vs（5.2±7.4）%，P＜0.05］，并下调CatS、VEGF-A、p-VEGFR-2、Ras、p-Raf、p-MEK1和p-ERK1/2蛋白的表达，且呈浓度依赖关系，提示蜂毒素有望成为Cat S抑制剂，为靶向治疗与Cat S相关的肝癌提供新的理论支持。

3 展望

Cat S基因作为一个新的促癌基因，许多研究已显示该基因过表达与多种肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关，有望成为治疗恶性肿瘤的新靶点。但仍存在一些问题，如Cat S基因是否为广谱促癌基因，能否作为肿瘤早期诊断的指标。此外，Cat S基因的促癌分子机制尚不清楚，仍需要进一步研究。尽管如此，该基因仍有望在肿瘤的早期发现、诊断与治疗中发挥重要的作用。随着对Cat S基因研究不断深入，将为肿瘤防治提供新思路和新观点。

［1］ Rawlings ND，Waller M，Barrett A J，etal.MEROPS：the database of proteolytic enzymes，their substrates and inhibitors［J］.Nucleic AcidsRes，2014，（Database issue）：D503-509.

［2］ Repnik U，Starr AE，Overall CM，et al.Cysteine c athepsins a ctivate ELR c hemokines and i nactivate n on-ELR c hemokines［J］.J Biol Chem，2015，290（22）：13800-13811.

［3］ Lalmanach G，SaidiA，Marchand-Adam S，et al.Cysteine cathepsins and cystatins：from ancillary tasks to prominent status in lung diseases［J］.Biol Chem，2015，396（2）：111-130.

［4］ Olson OC，Joyce JA.Cysteine cathepsin proteases：regulators of cancer progression and therapeutic response［J］.Nat Rev Cancer，2015，15（12）：712-729.

［5］ Stoka V，Turk V，Turk B.Lysosomal cathepsins and their regulation in aging and neurodegeneration［J］.Ageing Res Rev，2016，32：22-37.

［6］ Turk V，Stoka V，Vasiljeva O，et al.Cysteine cathepsins：from structure，function and regulation to new frontiers［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1824（1）：68-88.

［7］ Woo SM，Min KJ，Seo BR，et al.YM155 sensitizes TRAIL-induced apoptosis through cathepsin S-dependent down-regulation of Mcl-1 and NF-kappaB-mediated down-regulation of c-FLIP expression in human renal carcinoma Caki cells［J］.Oncotarget，2016，7（38）：61520-61523.

［8］ Kregar I，Locnikar P，Popovi'c T，et al.Bovine intracellular cysteine proteinases［J］.Acta Biol Med Ger，1981，40（10-11）：1433-1438.

［9］ Turnsek T，Kregar I，Lebez D.Acid sulphydryl protease from calf lymph nodes［J］.Biochim Biophys Acta，1975，403（2）：514-520.

［10］ShiGP，Munger J S，Meara JP，etal.Molecular cloning and expression of human alveolarmacrophage cathepsin S，an elastinolytic cysteine protease［J］.JBiol Chem，1992，267（11）：7258-7262.

［11］McGrath ME，Palmer J T，Bromme D，et al.Crystal structure of human cathepsin S［J］.Protein Sci，1998，7（6）：1294-1302.

［12］Levicar N，Strojnik T，Kos J，et al.Lysosomal enzymes，cathepsins in brain tumour invasion［J］.JNeurooncol，2002，58（1）：21-32.

［13］Jordans S，Jenko-Kokalj S，Kühl NM，etal.Monitoring compartmentspecific substrate cleavage by cathepsinsB，K，L，andSatphysiological pH and redox conditions［J］.BMC Biochem，2009，10：23.

［14］Pap T，Shigeyama Y，Kuchen S，et al.Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2000，43（6）：1226-1232.

［15］Wilkinson RD，Young A，Burden RE，et al.A bioavailable cathepsin S nitrile inhibitor abrogates tumor development［J］.Mol Cancer，2016，15：29.

［16］VazquezR，Astorgues-XerriL，BekraddaM，etal.Fsn0503h antibodymediated blockade of cathepsin Sas a potential therapeutic strategy for the treatment of solid tumors［J］.Biochimie，2015，108：101-107.

［17］Qin Y，Cao X，Guo J，et al.Deficiency of cathepsin Sattenuates angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in apolipoprotein E-deficientmice［J］.Cardiovasc Res，2012，96（3）：401-410.

［18］de Nooijer R，Bot I，von der Thüsen JH，et al.Leukocyte cathepsin S is a potent regulator of both cell and matrix turnover in advanced atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（2）：188-194.

［19］Sukhova GK，ZhangY，Pan JH，etal.Deficiencyof cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice［J］.J Clin Invest，2003，111（6）：897-906.

［20］Zhang L，Wang H，Xu J，et al.Cathepsin S as a cancer target［J］.Neoplasma，2015；62（1）：16-26.

［21］Shi GP，Sukhova Gk，Kuzuya M，et al.Deficiency of the cysteine protease cathepsin S impairsmicrovessel growth［J］.Circ Res，2003，92（5）：493-500.

［22］Wang B，Sun J，Kitamoto S，et al.Cathepsin Scontrolsangiogenesis and tumor growth via matrix-derived angiogenic factors［J］.J Biol Chem，2006，281（9）：6020-6029.

［23］Burden RE，Gormley J A，Jaquin TJ，etal.Antibodymediated inhibition of cathepsin Sblocks colorectal tumor invasion and angiogenesis［J］.Clin Cancer Res，2009，15（19）：6042-6051.

［24］Chen H，Wang J，Xiang MX，et al.Cathepsin S-mediated fibroblast trans-differentiation contributes to left ventricular remodelling after myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2013，100（1）：84-94.

［25］Li X，Cheng XW，Hu L，etal.Cathepsin Sactivity controls ischemiainduced neovascularization in mice［J］.Int JCardiol，2015，183：198-208.

［26］Wilkinson R D，Williams R，ScottCJ，etal.Cathepsin S：therapeutic，diagnostic，and prognostic potential［J］.Biol Chem，2015，396（8）：867-882.

［27］Tsai JY，Lee MJ，Dah-Tsyr Chang M，et al.The effect of catalase on migration and invasion of lung cancer cellsby regulating theactivities of cathepsin S，L，and K［J］.Exp Cell Res，2014，323（1）：28-40.

［28］Kos J，Sekirnik A，Kopitar G，et al.Cathepsin S in tumours，regional lymph nodes and sera of patients with lung cancer：relation to prognosis［J］.Br JCancer，2001，85（8）：1193-1200.

［29］Small DM，Burden R E，Jaworski J，etal.Cathepsin S from both tumor and tumor-associated cellspromote cancer growth and neovascularization［J］.Int JCancer，2013，133（9）：2102-2112.

［30］LindahlC，SimonssonM，BerghA，etal.Increased levelsofmacrophagesecreted cathepsin S during prostate cancer progression in TRAMP mice and patients［J］.Cancer Genomics Proteomics，2009，6（3）：149-159.

［31］Di Gioia D，Blankenburg I，Nagel D，et al.Tumor markers in the early detection of tumor recurrence in breast cancer patients：CA 125，CYFRA 21-1，HER2 shed antigen，LDH and CRP in combination with CEA and CA 15-3［J］.Clin Chim Acta，2016，461：1-7.

［32］Basu S，Harris H，Larsson A，et al.Is t here a ny r ole for s erum Cathepsin S and CRP l evels on p rognostic i nformation in b reast c ancer？t he s wedish m ammography c ohort［J］.Antioxid Redox Signal，2015，23（16）：1298-1302.

［33］LiuWL，Liu D，Cheng K，etal.Evaluating thediagnostic and prognostic value of circulating cathepsin S in gastric cancer［J］.Oncotarget，2016，7（19）：28124-28238.

［34］Zhang L，Wang H，Xu J，et al.Inhibition of cathepsin S induces autophagy and apoptosis in human glioblastoma cell lines through ROS-mediated PI3K/AKT/mTOR/p70S6K and JNK signaling pathways［J］.Toxicol Lett，2014，228（3）：248-259.

［35］Flannery T，Gibson D，Mirakhur M，et al.The clinical significance of cathepsin S expression in human astrocytomas［J］.Am JPathol，2003，163（1）：175-182.

［36］Xu J，LiD，Ke Z，etal.Cathepsin S isaberrantly overexpressed in human hepatocellular carcinoma［J］.Mol Med Rep，2009，2（5）：713-718.

［37］Fan Q，Wang X，Zhang H，et al.Silencing cathepsin Sgene expression inhibitsgrowth，invasion and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425（4）：703-710.

［38］Wang X，Xiong L，Yu G，et al.Cathepsin S silencing induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells［J］.Am JTransl Res，2015，7（1）：100-110.

［39］Lee TK，Cheung V C，Lu P，et al.Blockade of CD47-mediated cathepsin S/protease-activated receptor 2 signaling provides a therapeutic target for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2014，60（1）：179-191.

［40］Zhang Z，Zhang H，Peng T，et al.Melittin suppresses cathepsin S-induced invasion and angiogenesis via blocking of the VEGF-A/ VEGFR-2/MEK1/ERK1/2 pathway in human hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Lett，2016，11（1）：610-618.

［2016-10-05收稿］［2016-12-16修回］［编辑 江德吉］

R73

A

1674-5671（2017）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.16

广西医科大学青年科学基金资助项目（GXMUYSF201542）；南宁市科学研究与技术开发计划资助项目（20153012，20163130）

黄海。E-mail：Huanghaidr＠163.com