大鼠颅骨骨缺损模型的建立及相关应用

李矛 赵彦涛 侯树勋

大鼠颅骨骨缺损模型的建立及相关应用

李矛 赵彦涛 侯树勋

大鼠；颅骨；骨缺损；组织工程

骨组织工程研究中，针对骨修复材料在体内实验评估与检测，首先需要通过动物实验得到相关的数据和结果[1-3]。O’Loughlin 等[4]在 2008年回顾近 10年 6种主要骨科杂志刊发的关于骨修复材料在动物模型评价资料发现：模型中，动物选择的频率分别为：大鼠 38%；兔子19%；小鼠 13%；羊 11%；狗 9%，山羊 4%；其它 4%。大鼠动物模型具有可重复性强、适宜于多种不同种类和类型材料的应用评估、经济性价比高、学习曲线较短等优点，广泛应用于骨组织工程中。与大动物模型相比，大鼠更易于饲养，社会关注度也较少[5]。大鼠颅骨与其它的骨骼组织相比，血运较差，一旦发生缺损后自我修复能力较差，而且颅骨骨组织便于建立统一、可重复性强的标准化缺损，比较容易应用影像学和组织学方法进行分析比较；颅骨骨组织的解剖结构便于进行动物实验的手术操作和术中的处理；颅骨下方的硬脑膜和其上的软组织可以为植入材料提供很好的支持，不需要对植入材料和缺损的骨组织进行固定[6-10]。现就大鼠颅骨缺损模型的相关应用报告如下。

一、大鼠颅骨缺损模型建立

Freeman 和 Turnbull[11]在 1973年首先描述了大鼠颅骨骨缺损的动物模型，选取实验动物为 15只，体重约 500g的中年 Wistar-Strain 大鼠。在其颅骨矢状缝左右两侧的顶骨区域分别钻取直径 2mm 的骨组织缺损进行修复材料的评估实验。目前，研究者在进行动物实验时，多利用低速环形钻头在大鼠颅骨骨组织表面制造圆形的缺损。通常选取成年雄性大鼠，盐酸氯胺酮 ( 40mg / kg ) 与盐酸甲苯噻嗪 ( 8mg / kg ) 联合麻醉，也有采用 10% 水合氯醛( 4ml / kg ) 腹腔注射麻醉[12]。大鼠头颅备皮、消毒铺巾后，从鼻骨开始，沿颅骨矢状线取纵行手术切口，长约1.5～3cm，逐层分离软组织，充分显露矢状缝、双侧顶骨及部分额骨和枕骨。根据圆形缺损直径大小的不同，在不同部位进行钻孔建模，直径≤6mm 一般在双侧顶骨处钻孔；直径＞6mm 一般以矢状缝为中心进行钻孔。钻孔前需将骨膜充分剥离，将不同直径的空心钻头连接电钻后，低速 ( ≤1500rpm ) 钻取，钻取过程中助手用生理盐水滴注 ( 1滴 / 2s ) 降温。钻取时动作需轻柔 ( 单纯凭借电钻的自然重力，尽量不附加外力 )，避免将骨组织完全钻穿，接近钻穿时用剥离器沿着圆形缺损周边进行钝性分离，从而避免硬脑膜及其下方的血管、脑组织的损伤。生理盐水冲洗术野，探查无活动性出血后，用 0号线逐层关闭皮下组织、皮肤切口。术后大鼠侧卧于 30℃ 恒温台进行麻醉复苏，完全清醒后送回饲养笼继续喂养，于术后 8～12h，20～24h，32～36h 分别予以丁丙诺啡 ( 0.05mg / kg )腹腔注射镇痛[13-15]。

二、大鼠颅骨缺损模型的相关影响因素

目前有关大鼠颅骨骨缺损模型建立的相关研究中，研究人员对临界骨缺损 ( the critical size defects，CSD ) 大小的选择、颅骨中央区域的单一缺损还是在双侧顶骨区域分布建立骨缺损、硬脑膜和骨膜是否进行屏蔽处理等问题都存在广泛的争议。在大鼠种系、性别、年龄等选择也都有不同的观点。

1. 大鼠种系、年龄及性别的选择：实验动物应根据研究目的及实验要求进行选择，一切用于研究的实验动物应具备遗传性能的稳定性，个体的均一性和比较容易得到、容易饲养等基本要求[16]。大鼠的种系一般选择 Sprague Dawley ( SD ) 大鼠和 Wistar 大鼠，这两个品种的大鼠生长较快、繁殖能力强，容易饲养，对传染病的抵抗力较强。其中，SD 大鼠较 Wistar 大鼠更为温顺，更容易进行实验操作而更受研究者欢迎。大鼠的年龄和雌激素都对骨缺损组织修复能力有影响，为避免对实验的结果产生干扰，研究者通常采用成年的雄性大鼠进行动物实验，SD 大鼠一般＞12周 ( 体重 300～350g )[17]。

2. CSD 的大小选择：Schmitz 和 Hollinger[18-19]在 1986年报道指出，动物颅骨及颌面部的骨缺损能否完成自我修复和缺损面积的大小正相关，从而提出了 CSD 的概念。CSD 定义为动物体内的骨组织缺损，在自然状态下终生或在实验周期内不能自行达到骨性愈合。在大鼠颅骨缺损模型中，一般将圆形缺损的直径用来描述和 CSD 的关系，其大小在应用时具有一定的争议，文献报道的 CSD 从 2～8mm 不等，现在较多使用的 CSD 是 5mm 和 8mm。

Bosch 等[20]认为：大鼠颅骨缺损直径为 5mm 时，除了在缺损边缘处有少量的骨形成之外，直到术后 12个月都不能完成骨性修复。Ferreira 等[21]研究辛伐他汀在骨组织修复过程中的局部应用时，使用了 3个月的雄性 Wistar大鼠 ( 280～300g ) 作为动物实验的模型，其 CSD 为5mm。术后 30天和 60天的扫描电镜、HE 染色以及一系列免疫组化染色的结果提示：在大鼠颅骨骨缺损处，辛伐他汀通过包含于微球中的局部释放作用，可以明显提高骨缺损处新骨形成量以及骨组织的矿化。Florczyk 等[22]在研究多孔壳聚糖－藻酸盐支架在颅骨缺损修复应用时，使用的动物模型为 4周的雌性 SD 大鼠、CSD 为 5mm 的颅骨缺损。其实验结果表明多孔壳聚糖－藻酸盐支架复合BMP-2与单纯支架、支架复合 BMSc 相比，其新骨形成量和骨组织的矿化程度都要明显提高。Petridis 等[23]在用人牙髓干细胞复合到细胞外基质支架，然后用于修复大鼠颅骨骨缺损的研究中，其动物实验是 30只 4个月龄的雄性Wistar 大鼠，其中 14只大鼠是双侧建立缺损，16只是单侧建立缺损，CSD 是 5mm，并且尽量保护硬脑膜不受损伤。实验结果提示单纯的空白对照组是在骨缺损的周边只有少量的新骨生成，不能完成骨修复；复合人牙髓干细胞复合到细胞外基质支架组的新骨量明显增加，未完成完全修复，考虑和所选用的细胞支架降解过快有关。Annibali等[24]在使用 Micro-CT 和 PET 进行定量分析人牙髓干细胞复合于可降解支架植入大鼠颅骨缺损模型后的骨修复时，大鼠颅骨缺损模型采用的是在大鼠矢状缝双侧的左右顶骨分别用环钻建立 2个直径为 5mm 的圆形缺损。作者将大鼠分为两组，每组使用不同的支架材料进行植入。A 组的大鼠颅骨双侧两个骨缺损分别植入无机牛骨颗粒 ( granular deproteinized bovine bone，GDPB ) 支架复合人牙髓干细胞( dental pulp stem cells，DPSCs ) 和单纯 GDPB 支架；B 组则分别植入 β-磷酸钙 ( Beta-tricalcium phosphate，β-TCP)支架复合 DPSCs 和单纯 β-TCP 支架。在术后 2周、4周、8周、12周分别行 Micro-CT 和 PET 检查，并利用分析软件分析结果显示 GDPB 复合 DPSCs 组与单纯 GDPB 支架组都有比较好的骨再生，但两者在标准化摄取值 ( standard uptake value，SUV ) 和骨密度值 ( bone mineral density，BMD ) 方面，前者比后者稍高，但差异无统计学意义；β-TCP 支架复合 DPSCs 与否都在 4周时支架降解，在12周时有骨再生，但 SUV 和 BMD 都要明显低于 GDPB 支架组。

研究人员采用 CSD 为 5mm 的理由是可以在大鼠颅骨矢状缝的左右两侧，建立单个或者两个骨缺损。这样首先可以避免损伤矢状缝，避免矢状窦组织里的间充质干细胞和具有成骨作用的相关细胞因子进入缺损处，干扰实验结果[25]。而且由于在 1只大鼠颅骨上可以同时建立两个骨缺损，两者进行自我对照研究的同时，也减少了动物的使用数量。缺点是大鼠颅骨双侧的两个缺损，由于彼此存在的缘故，可以允许物质在两者之间进行扩散和交换，从而会在一定程度上相互影响两个缺损处的修复和骨再生，对动物实验的结果产生一些干扰[26]。另一方面，因为研究人员一般会潜意识地选取一个更加大的 CSD 来增加自己的实验难度，从而使实验所评估的修复材料成骨性能更具有说服力，因此很多研究人员采用 CSD 为 8mm 的大鼠颅骨缺损模型。

Herberg 等[27]为了探讨不同剂量 SDF-1β 复合 BMP-2后的成骨效应，将不同剂量的 SDF-1β 与 BMP-2复合至可吸收的明胶海绵支架上 ( absorbable collagen sponge，ACS )，然后用于修复大鼠颅骨骨缺损。动物实验中，作者使用了 172只 11～13周的雄性 SD 大鼠，利用环钻在大鼠头颅人字缝前方、矢状缝的正上方制造一个直径为8mm 的圆形缺损，并将不同剂量的 SDF-1β 复合 BMP-2的 ACS 支架材料植入缺损处，并在缺损的上方用圆顶状的钛微孔板进行保护。术后 4周的 X 线和 Micro-CT、HE 染色等结果提示骨缺损的修复程度和 BMP-2的剂量正相关；选取一个较小的 BMP-2浓度 ( 0.5μg ) 和不同浓度的 SDF-1β 复合时，骨缺损的修复程度和 SDF-1β 的剂量正相关，而且和单纯高剂量 BMP-2相比，差异没有显著性。Li 等[28]在进行大鼠颅骨缺损修复的研究中，利用牛血清蛋白 ( BSA ) 纳米颗粒包裹 BMP-2和地塞米松( DEX )，并溶解于聚己内酯－聚乙二醇 ( PCE ) 溶液中，通过静电纺丝技术制备成纳米纤维支架，在支架上种植BMSc 细胞后，将其用于颅骨缺损处的原位修复。实验中，将 36只 SD 大鼠随机分为 6组，每只大鼠颅骨缺损为直径 8mm 圆形缺损。实验观察发现，在 4周时骨缺损边缘开始有少量骨组织生成，在 12周时，BMP-2/ DEX 支架组修复的骨缺损面积为 ( 91.57±5.42) %，无任何支架的空白对照组无骨组织修复。

随着骨组织修复过程中的问题和挑战越来越多，尽管有一些比 CSD 要小的颅骨缺损模型也应用于评估骨组织修复过程中的一些生理或者病理的条件和情况，以及一些硬组织相关手术操作的优化，但是 CSD 为 5mm 或者8mm 还是被大多数研究者所共识[29-32]。

3. 硬脑膜和骨膜是否屏蔽处理：硬脑膜在颅骨缺损修复过程中起着非常重要的作用，其不仅是成骨细胞的一个来源中心，同时提供大量骨组织修复过程中具有骨诱导和成骨作用的细胞因子[33-34]。Denicolo 等[35]做了大量的实验，采用聚四氟乙烯膜 ( polytetrafluoroethylene，PTFE ) 物理性地将颅骨缺损边缘的骨性结构与硬脑膜、骨膜进行隔离，从而阻止来自颅骨缺损边缘的外周细胞参与到纤维膜性结构与硬脑膜、骨膜之间的骨形成过程中。实验结果显示，在骨膜和 PTFE 膜之间、PTFE 膜和硬脑膜之间有大量新骨生成，表明骨膜和硬脑膜具有骨诱导和促进新骨形成的作用，而形成新生骨组织的前驱细胞，其增殖和分化都来源于骨膜和硬脑膜。Esther 等[36]在研究生物活性膜体外骨组织矿化和动物体内骨缺损修复实验中，通过21只雄性 SD 大鼠 ( 12周龄，425～475g ) 的颅骨缺损模型观察体内骨缺损的修复情况，在大鼠颅骨矢状缝右侧的顶骨处，利用环形钻头制造一个直径为 5mm 的圆形骨缺损，将不同种类的生物活性膜覆盖于缺损表面。术后 7天的 Micro-CT 结果显示，含有 HAP [[( VPGIG )2( VPGKG ) ( VPGIG )2]2DDEEKFLRRIGRFG [( VPGIG )2( VPGKG ) ( VPGIG )2]2]3。

这一氨基酸序列的生物活性膜组，其新骨的生产量明显高于其它组。术后的 HE 染色以及 Masson 染色的结果也提示在生物活性膜的下方，在硬脑膜的上方有大量的新骨形成和骨组织的矿化。Honma 等[37]在关于大鼠颅骨缺损的不同 CSD 进行骨修复的研究中也发现，成骨细胞的骨修复主要发生在硬脑膜和骨膜处，而不是缺损边缘，认为这主要是和成骨细胞及其前体细胞、相关的细胞因子主要来源于硬脑膜和骨膜。硬脑膜处的新骨生成更加的明显，也说明了硬脑膜是促进成骨的重要相关因素。而且，众多的研究者在进行建模操作时，都重点强调了动作需要轻柔，尽可能地避免硬脑膜在操作过程中受到损害。

综上所述，笔者发现在动物实验中，理想的骨缺损模型应包括以下几个特点[13,27,38-40]：( 1) 高度可重复性；( 2)可用于多种不同类型材料的应用评估与检测；( 3) 尽可能与临床实际情况相关联；( 4) 可以应用于多种不同的分析方法；( 5) 实验动物具有较低的患病率与病死率。除此之外，还有几个因素需要考虑，例如动物模型建立的学习曲线、动物饲养条件的要求以及动物的经济性等。在骨组织工程研究过程中，很多的研究者都选用大鼠颅骨缺损模型作为动物实验对支架材料进行评估。但是在模型的建立过程中，大家通常都会选择成年雄性的 SD 大鼠做为实验动物。在 CSD 选择 5mm 还是 8mm、建模时是选择中央缺损还是双侧缺损、是否考虑矢状缝的损伤、硬脑膜和骨膜是否进行屏蔽等方面都存在争议。动物模型的相关参数不能完全统一，必然会干扰不同实验结果之间的比较。为了在骨组织工程研究中能够更加客观地评估研究对象，则需要对这些相关的影响因素进行一一明确，将动物模型标准化。

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( 本文编辑：裴艳宏 )

Establishment and relative applications of the rat calvarial bone defect model

LI Mao, ZHAO Yan-tao, HOU Shuxun.
Institute of Orthopedics, the fi rst aff i liated Hospital of the PLA General Hospital, Beijing, 100048, China Corresponding author: HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

The rat calvarial bone defect model is widely applied in bone tissue engineering, especially in the animal model for bone grafting materials and relative cytokines. There are many disputes on the diameter size of the critical size defects ( CSD ), unilateral or bilateral defects, whether to shield the dura mater and pericranium during the process of establishing the rat calvarial bone defect model. Based on our literature review, there are many different disputes about the species, sex, and age of rats. We’ve conf i rmed that male adult ( 10- 12weeks, 300- 350g , Sprague Dawley / SD ) rats are preferred in the model establishment. When the CSD is 5mm, the researcher can make a selfcomparison and avoid the damage of the sagittal suture, thus reduce the number of rats with the bilateral defects at the same time. When the CSD is 8mm, a larger range of defects may be established, so as to make the experimental results more convincing. The dura mater and pericranium can promote the repair of calvarial bone defects as intramembranous bone growth sites. Therefore, we may consider shielding the dura mater and pericranium during the process of evaluating the bone repair materials and relative cytokines to avoid the interference on the results.

Rats; Skull; Bone defect; Tissue engineering

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.08.014

R683, R318

100048 北京，解放军总医院第一附属医院、北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心、全军骨科研究所( 李矛、赵彦涛、侯树勋 )；100048 北京，解放军第 306医院 ( 李矛 )

侯树勋，Email: hsxortho@hotmail.com

2016-07-15)