肠道微生态与急性胰腺炎

刘丽燕 王兴鹏 曾悦

·综述与讲座·

肠道微生态与急性胰腺炎

刘丽燕 王兴鹏 曾悦

急性胰腺炎(AP)多急性起病，是常见的急腹症之一。病程中有20%～30%的患者会发展为重症急性胰腺炎(SAP)[1-2]，通常表现为早期即可出现全身炎症反应综合征(SIRS)，发展为一个或多个器官持续性功能衰竭，并伴有局部并发症，病死率在重症监护室或医院可分别高达27%或39%[3]。

肠道微生态研究肠道微生物群的结构、功能及其与宿主相互依赖和相互制约的关系。近年研究表明，肠道微生态失衡，肠道细菌比例失调，肠屏障功能损伤，肠道细菌易位，条件致病菌、非条件致病菌过度增殖等是促使SAP时感染性并发症发生的主要因素。本文就近年来肠道微生态与AP的关系及治疗中的应用和研究展望做一综述。

一、肠道微生态组成

肠道微生态由肠道菌群、肠黏膜上皮及肠道黏膜免疫系统3部分组成，其中肠道菌群发挥最重要的作用。在人体胃肠道中的微生物总量超过1014，其中包括细菌、古细菌、真核生物、噬菌体和病毒[4]。肠道微生物宏基因组测序证实，人类肠道微生物基因数目是人类基因的100～150倍，其中超过99%来自细菌，共发现1 000～1 150种常见细菌，其中78%是新发现的[5]。肠道细菌主要居于结肠和远端小肠。可分为3种：(1)与宿主共生的生理性细菌。双歧杆菌属、类杆菌属和消化链球菌属等专性厌氧菌，约占肠道总菌量的90%以上，是肠道的优势菌群，为膜菌群的主要构成者。(2)与宿主共栖的条件致病菌。肠杆菌科、肠球菌属等兼性厌氧菌为肠道非优势菌群，在肠道微生态平衡时是无害的，在特定条件下具有侵袭性，对人体有害。(3)病原菌。如变形杆菌、假单胞菌和韦氏梭菌，大多为过路菌，长期定植的机会少，生态平衡时这些菌数量少，不会致病，如数量超过正常水平，则可引起人体发病。在机体免疫功能正常时，肠道细菌对宿主不构成损害，各菌种相互抑制、相互拮抗，维持着肠道内的微生态平衡。

二、肠道微生态生理功能

1．构建和维持肠道屏障：肠道屏障由肠上皮细胞层、黏液层、肠道正常菌群、肠道免疫系统、肠-肝轴、防御素等组成，具有微生物屏障、机械屏障、化学屏障、免疫屏障等功能。

(1)微生物屏障：主要由正常的肠道菌群及其分泌物构成，是对外来菌株有定植抵抗作用的肠内正常寄生菌群。健康人的胃肠道中存在大量菌群，其分布因部位各异，胃和空肠内主要是需氧菌，回肠和盲肠厌氧菌较多，结肠内90%～99%均为无芽孢厌氧菌。肠道常驻菌与宿主的微空间结构形成了一个相互依赖又相互作用的微生态系统。(2)机械屏障：指肠黏膜上皮细胞层(包括柱状上皮细胞、杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞、M细胞、未分化细胞及散在其间的上皮间淋巴细胞)的完整性及上皮细胞间的紧密连接，细胞桥粒连接，缝隙连接，黏液(黏蛋白)、上皮细胞快速更新等，是保持肠屏障功能的主要因素。它们可防止肠腔内大分子物质向肠壁渗透，能有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入血液，维持肠道内稳态。其中肠上皮不断更新是保持黏膜屏障完整性的重要机制。(3)免疫屏障：由肠黏膜淋巴组织(Peyer结、肠系膜淋巴结)、 细胞(上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、M细胞等)和肠黏膜表面的分泌型抗体(sIgA)等构成，肠黏膜下组织具有重要的防御功能，可调节肠内可溶性和颗粒性抗原的局部免疫反应。sIgA可以调节肠道微生态系统的组成和功能[6]，对一些抗原物质具有封闭作用，能覆盖在肠道内可溶性抗原的表面，阻止其与肠黏膜上皮细胞的结合，防止其侵入肠黏膜固有层，增强肠黏膜的屏障功能[7]。slgA还具有对嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒作用和ADCC作用。(4)化学屏障：包含胃肠道的各种生理性分泌，如胃肠液、黏液、防御素等。肠腺潘氏细胞产生的抗菌肽，如防御素、隐窝蛋白、溶菌酶、磷脂酶A2等在肠上皮表面和肠腔中发挥杀菌和抑菌作用，保护肠黏膜免受物理摩擦、酶及消化液的损伤。

2．营养代谢功能：肠道微生物参与胆碱代谢，参与维生素如维生素B12，叶酸、硫胺素与氨基酸的合成，并促进机体对铁、钙的吸收[8]。大肠埃希菌有合成B族维生素和维生素K的功能，并有降解食物残渣、抑瘤、抗衰老的作用。肠道菌群发酵不被小肠吸收的食物残渣，将糖类部分转化成短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)，其终端产物主要为乙酸、丙酸和丁酸，为宿主和微生物本身提供能量和营养物质，其中如丁酸等SCFAs是肠道上皮细胞重要的能量来源[9]。

3．抑制外源性潜在致病菌：正常菌群如双歧杆菌可通过磷壁酸黏附作用占据于肠上皮细胞表面，形成一层菌膜屏障, 抑制肠道内(主要为肠杆菌科细菌)以及外源性潜在致病菌对肠上皮细胞的黏附、定植，起占位性保护作用。同时肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等生理有益菌还有多种生物拮抗功能, 如通过产生SCFAs降低肠道局部pH，通过争夺营养产生具有广谱抗菌作用的物质如亲脂分子、小菌素、过氧化氢等, 对肠内大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、链球菌等起抑菌或杀菌作用, 抑制肠道外源性潜在致病菌生长。SCFAs还可通过直接或间接的途径促进胃肠道的蠕动，使外源性潜在致病菌尚未在黏膜表面黏附、定植前就被排出体外。

4．构建和调节免疫/神经系统功能：肠道微生物有助于宿主肠道先天性和获得性免疫系统的建立和维持。目前认为肠道微生态系统主要通过与肠黏膜上皮细胞TLRs和NODs 2种受体结合，诱导上皮细胞增殖，加固肠黏膜上皮细胞之间的连接，增强肠黏膜淋巴组织(GALT)抵御病原体入侵的能力，减轻肠道的炎症反应，维持肠道稳态[10]。另外，肠道微生物代谢产物SCFAs类也参与肠道健康和免疫稳态的调节[11]。肠道微生物群落参与脑-肠轴功能的构建，影响宿主肠道局部和中枢神经系统功能。

三、AP时的肠道微生态

1．肠道菌群失调：Gerritsen等[12]用T-RFLP分析16S rRNA基因片段显示AP时十二指肠的条件致病菌较正常大鼠翻一倍，而末端回肠条件致病菌仅轻度升高，同时研究显示宿主正常的回肠微生态群在AP时由特异性的“急性胰腺炎相关微生态群”所取代，这些异常细菌种类与象牙海岸梭菌密切相关。研究显示，AP时十二指肠潜在致病菌如溶血性链球菌B族、肠球菌、金黄色葡萄球菌和肠杆菌科如大肠杆菌、奇异变形杆菌、摩氏摩根菌数量明显增加。Tan等[13]用PCR-DGGE分析研究显示AP时粪便的菌群结构与种类发生了明显的变化，而且SAP并发MOF和感染并发症的患者肠道菌种改变较轻症AP更为明显，肠杆菌科和肠球菌数量明显增加而双歧杆菌数量显著下降，但乳酸杆菌数量下降不明显，血浆IL-6、内毒素水平与肠杆菌科和肠球菌数量呈正相关，血浆IL-6水平与双歧杆菌呈负相关，提示AP时肠道的菌群失调介导了炎症反应，促进了疾病的进展。

2．肠道屏障功能障碍：肠道屏障功能障碍( intestinal barrier dysfunction，IBD) 是 SAP 发展为MOF的重要原因之一。Fishman等[14]研究显示，小鼠不同模型的AP在造模6 h后均出现肠道黏液层的破坏，并伴随之后的肠道通透性增加。孙丽群等[15]研究显示，大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)时回肠黏膜上皮细胞微绒毛萎缩、排列稀疏、细胞间连接松弛、数量减少甚至结构模糊，且上皮细胞坏死、凋亡较多，肠道通透性明显增加。机制可能为：(1)缺血再灌注损伤和微循环障碍。在ANP时，大量液体渗出至第三间隙，肠道有效血容量急剧减少，肠道缺血缺氧，再加上液体复苏后缺血再灌注损伤，使得黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤在组织中堆积，并产生大量的氧自由基，造成脂质过氧化反应损伤肠道黏液层及肠上皮细胞，导致肠上皮细胞功能障碍及结构破坏[14]。NO在缺血再灌注的过程中被超氧化物离子转化为有细胞毒性的亚硝酸盐，损害上皮细胞，加速肠道绒毛破坏。(2)细胞因子和炎性递质大量释放。AP时在各种致病因素的刺激下，钙离子进入胰腺腺泡细胞引起NF-κB的大量激活，缺血再灌注时的氧自由基又刺激中性粒细胞，进而引起TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、PAF、ICAM-1等细胞因子和炎性递质表达上调，其中TNF-α是AP时最早升高并在SIRS中起核心作用的炎症递质。这些炎症因子相互诱导刺激，造成细胞因子及炎性递质的大量释放，引起级联反应，损害细胞膜结构，破坏肠道上皮细胞，使肠道通透性增加，促进细菌和内毒素易位[16]。(3)肠黏膜细胞凋亡。SAP时TNF-α等炎症因子瀑布样释放、肠缺血-再灌注损伤，形成严重的氧化应激反应，进一步激活caspase-3通路，导致肠黏膜细胞凋亡增加，也是肠黏膜屏障功能受损的重要机制[17]。(4)肠上皮细胞间紧密连接破坏。肠上皮细胞紧密连接为动态通透性屏障，可阻止潜在的病原体侵入机体，同时让营养物质、离子和水进入体内。组成紧密连接的蛋白主要有咬合蛋白(occlaudin)、闭合蛋白(claudin)、紧密黏附分子(junction adhesion molecule)及连接复合物蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3、p130、7H6、Symplekin)。研究显示，SAP时ZO-1、occlaudin表达降低而claudin-2表达上升，进而使肠上皮细胞紧密连接松弛，致肠通透性增高，促进肠道菌群易位，其机制可能为上调Arpin蛋白，抑制Arp2/3复合体，使F肌动蛋白集合体减少，细胞骨架重排[18]。

3．肠道菌群易位：AP时发生肠道菌群易位非常常见，肠道内病原体大量繁殖，内毒素生成增加，通过受损的肠黏膜屏障致使肠道菌群易位，发生败血症，导致SIRS、MODS的发生。研究者给ANP大鼠肠内注射经荧光蛋白转染的大肠杆菌后，通过体内视频显微镜观察，发现短时间内实验组动物胰腺组织内就可以检测到标记的大肠杆菌，而对照组检测结果为阴性。Zou等[19]在诱导大鼠产生AP后第8天，肠外器官胰腺、肝、脾、肺、肠系膜淋巴结均可出现感染，并可培养出源于肠腔的大肠杆菌、阴沟肠杆菌、摩根氏变形杆菌和克雷伯杆菌等革兰阴性菌。Karen等[20]研究也显示，在大鼠ANP后48 h可在肠系膜淋巴结、胰腺、肺组织中培养出肠球菌和大肠埃希菌。

4．肠免疫功能紊乱：sIgA是肠道分泌物中含量最丰富的免疫球蛋白，在SAP早期时(AP发生的24 h以内)就可以出现肠道免疫功能抑制，常特征性地表现为肠道sIgA分泌明显下降以及肠道黏膜中CD4+的T淋巴细胞数量减少，而这两项指标的下降又是导致内毒素吸收、菌群易位的重要原因[16]。研究显示，SAP时单核巨噬细胞系统吞噬功能低下以及细胞免疫功能受抑制，T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+和CD8+细胞数量均降低，CD4/CD8比值明显下降，且Th1/Th2辅助性T 细胞比值亦明显减低，进而加重了SAP的进程[21]。在SAP早期给予肠内营养后(48 h)可明显增加血浆lgG水平及T淋巴细胞HLA-DR的表达，也因此降低了SIRS、MODS及胰腺感染的概率[22]。

Th1细胞分泌 IL-2、TNF-α、IFN-γ等介导细胞免疫，包括激活CD8+CTL及巨噬细胞产生炎症反应；Th2细胞通过分泌IL-2、IL-4、IL-6、IL-8等辅助B细胞产生抗体介导体液免疫，Th3和Tr细胞通过分泌IL-10和 TGF-β下调免疫。AP时Th1、Th2及其他免疫细胞被激活，大量分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-18等细胞因子促进AP发生。动物研究显示，通过抗体、受体拮抗剂或生物合成抑制剂抑制促炎因子IL(如1L-1、IL-6、IL-8和IL-18)的作用可缓解SAP时胰腺及肺部损伤，降低相关病死率[16]。在SAP过度炎性反应时期，血清抗炎因子IL-10水平远低于TNF-α等促炎因子的水平，不能发挥有效的抗炎作用，提高循环中IL-10或其有效片段(IT9302)的水平则可降低血清TNF-α水平，减轻胰腺损伤，降低病死率[23]。

AP时巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞在单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和CCL5等趋化因子及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的帮助下，向炎性反应发生部位迁移并释放促炎细胞因子和趋化因子，进而使更多免疫细胞参与进来，加重炎性反应，这些免疫紊乱更加重了AP时肠黏膜的损伤[24]。动物实验表明，ICAM-1抗体能减少AP时炎性细胞浸润，减轻胰腺和肺部损伤[16]。

四、微生态制剂治疗AP

微生态制剂包括益生菌、益生元和合生元。世界卫生组织将益生菌定义为适当摄取后能对机体产生有益作用的微生物；益生元是促进体内益生菌生长并增进宿主健康的物质；合生元是益生菌与益生元合并使用的制剂。

随着对AP肠源性感染的认识，如何防治受到临床医师的关注。抗生素的应用、局部的肠道去污术及实施早期肠内营养的效果得到了肯定。相对于抗生素而言，益生菌制剂具有天然、符合生理、对患者副作用小等优势，被认为是未来有广阔前景的辅助治疗手段之一。肠道微生态制剂作为AP的辅助治疗方法在动物实验和临床研究中已有初步报道。

1．肠道微生态制剂使用的阳性结果：Hooijmans等[25]Meta分析结果显示，益生菌的添加没有明显降低也没有增加AP病死率[OR0.54(0.24，1.22)；n=3]，但却降低了AP组织病理学评分[SMD-1.35(-2.43，-0.26)；n=6；P=0.015]，同时也明显减少了AP的菌群易位[OR0.24(0.06，0.99)；n=5；P=0.049]和肠系膜淋巴结炎[OR0.25[0.11，0.58]；n=8；P<0.01]。且相比较多菌种及AP前给予益生菌，单一菌种益生菌及AP后给予效果更理想。此Meta分析不足之处在于绝大多数动物实验中并没有将AP病死率纳入检测指标，尤其是益生菌介导AP后期菌群易位导致感染并发症的病死率可能更有价值，所以针对病死率的结论尚有待争议。同时因为入组的样本量少，而且各实验组动物种类不同，给予益生菌的时间、种类不同(单一或混合菌种)，投入的部位不同(胃、空肠、十二指肠)，并且部分实验随机双盲设计欠缺，故Meta分析的可靠性相对偏低。

Zou等[19]将18只ANP猪随机分为肠外营养(PN)、肠内要素营养(ENE)及肠内免疫微生态营养(EIN)3组，分别在造模前及造模后24 h和给予营养1、2、4、6、8 d后检测血浆T淋巴细胞(CD3+、CD4+、CD8+)及slgA、lgG、lgM、内毒素，营养第8天后进行细菌定性、定量检测及组织学分析，结果显示各组病死率差异无统计学意义，营养后各时间段EIN组外周血内毒素、肠道通透性明显低于PN组和EEN组(P值均<0.05)，且血浆内毒素水平与肠道通透性密切相关。EIN组胰腺和远隔脏器细菌数及细菌易位率(11.1%)均明显低于PN组(80%)和EEN组(36.7%)(P值均<0.05)，同时EIN组小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛形态正常率(79%)均高于EEN组(47%)和PN组(13%)(P值均<0.05)，提示EIN能保护ANP猪肠道屏障功能，降低肠道通透性，减少细菌及内毒素易位。研究进一步显示EIN组肠道slgA、lgG的分泌水平及CD3+，CD4+的T淋巴细胞数量、CD4+/CD8+比值均较其他两组升高(P值均<0.05)，提示EIN可能通过改善肠道及机体的细胞、体液免疫功能而发挥作用。此研究是肠内营养加上益生菌，EIN中含有益生菌、谷氨酰胺、精氨酸，三者相辅相成，可为肠道上皮细胞和免疫细胞提供能量，促进肠道上皮细胞快速增殖，并改善肠道血液循环，保护肠道黏膜屏障，但分组不够细，若再加与单纯益生菌组做对比则研究效果更理想。

聂佳佳等[26]选取微生态制剂应用于444例SAP患者的随机对照试验(RCTs) 进行Meta分析，结果显示，虽然干预组与对照组间病死率以及感染性坏死发生率差异无统计学意义，但干预组住院时间(WMD=-6.72，95%CI-9.16～-4.28，P<0.00001)以及血淀粉酶、CRP恢复时间和腹部症状缓解时间均显著短于对照组，且总体并发症发生率显著低于对照组(OR=0.39，95%CI0.16～0.95，P=0.04)，提示微生态制剂对SAP的治疗有益，可降低总体并发症的发生。但此Meta分析纳入的研究数量较少，且有5项研究样本量均较小，研究质量偏低，并存在发表偏倚。Wang等[27]将2006年1月至2011年11月入院的183例SAP患者随机分为3组，分别予以PN(n=60，2 g蛋白·kg-1·d-1，35 kcal·kg-1·d-1，非蛋白质热量和含氮量比为120∶1)，EN(n=61，入院48 h给予百普素，2 g蛋白·kg-1·d-1，35 kcal·kg-1·d-1)及EIN(n=62，入院48 h给予百普素+枯草杆菌及肠球菌胶囊0.5 g tid po)2周，结果显示，与其他两组相比EIN组14 d后胰腺炎APACHEⅡ评分最低(P<0.05)，并且脓毒血症(12.9%，P<0.05)、MODS(11.3%，P<0.05)及病死率也最低(8.1%)，EIN组炎症因子血浆IL-10浓度最高(P<0.05)，TNF-α和IL-6浓度明显降低(P<0.05)，肠道致病菌群比例(15.6%)也最低，提示早期EIN可以降低SAP的炎症反应，改善预后。该研究为随机对照双盲试验，若能增加单纯益生菌组则效果更佳。

2．肠道微生态制剂使用的阴性结果：van Baal等[28]将40只SD大鼠分为AP组(n=9)、益生菌治疗组(n=10)、肠内营养组(n=10)、益生菌+肠内营养组(n=11)，益生菌和安慰剂在诱导AP前4 d给予，肠内营养在诱导AP前1 d给予，诱导AP 6 d后结束实验，结果显示各组血清淀粉酶、体重、胰腺病理损伤、小肠病理变化、菌群易位、病死率差异均无统计学意义(P值均>0.05)，提示益生菌对改善SAP效果不佳。另有引起全世界广泛关注的来自荷兰的一项为期4年的多中心、随机、双盲、对照临床试验(PROPATRIA)结果[29]。他们将预测为SAP的296例患者随机分为治疗组(153例)和对照组(145例)，在常规治疗的同时，入院48 h内肠道给予规定剂量的多菌种益生菌(Ecologic 641，1010/d)或安慰剂，2次/d，共28 d，观察住院期间及出院后90 d内患者感染性并发症等的发生情况。结果显示，治疗组的继发感染率(包括菌血症、肺炎、胰腺坏死感染、尿路感染、腹水感染等)为30%，对照组为28%，RR1.06，95%CI0.75～1.51，两组差异无统计学意义(P=0.80)，但治疗组的病死率显著高于对照组(16%比6%，RR2.53，95%CI1.22～5.25)，83%的治疗组和78%的对照组患者均死于MOF。因肠缺血死亡的治疗组患者也显著高于对照组，差异有统计学意义(9例比0例，P=0.004)。研究结果表明预防性应用益生菌不但没有降低SAP感染性并发症的发生率，反而增加了患者死亡的危险性。作者推测应用益生菌会增加SAP患者肠缺血事件发生率，其原因可能在于肠道给予的益生菌会增加肠道耗氧量，加重SAP时已经存在的肠道血供不足情况。此外，肠道菌量的高负荷可能加重肠道局部的炎性反应，减少肠道微血管血流，引起缺血。该研究发表后受到了来自世界各地学者提出的从研究设计到统计方法缺陷等方面的质疑，但该研究仍然为益生菌应用于重症患者的安全性和有效性提出了继续研究的必要性。

五、肠道微生态和AP的研究展望

微生态制剂治疗AP的研究多集中在SAP，研究者的实验结果分歧很大。有的学者认为益生菌有利于降低胰腺炎的感染率与病死率，可缩短患者住院时间，它具有免疫调节作用，有利于肠道正常菌群的重建，可抑制肠道细菌的易位，值得在临床上推广应用；另有一些学者却认为益生菌的使用加重了胰腺炎患者的感染，感染并发症的发生率和病死率上升，应慎用益生菌。分析益生菌对SAP疗效差异可能与样本量的大小、研究设计以及质量控制有关；试验对象基线水平的控制不佳也会影响结果判断；与益生菌的应用时间及所选用益生菌种类有关；与SAP患者的个体差异、益生菌应用疗程长短、剂量大小以及药物干预等有关。不同的菌种、不同的剂量以及不同的宿主可能产生的影响也不同。对于从动物模型中得出的结论，可能并不适用于人类。

益生菌可通过多个环节介导SAP的疾病进展，因此在今后研究中要重视微生态制剂的选择与应用，可采用16S rRNA基因表达谱分析、宏基因组测序等生物学技术，开发更有效的益生菌种；在微生态制剂制备中，研发合适的包埋技术，提高菌体耐恶劣环境的抗性并有效维持益生菌的活性；研究益生菌的最佳剂量、不同菌种的选择与合适的比例以期发挥益生菌的最大功效，并可进一步研究促进益生菌功效的协同制剂及如何提高益生菌使用安全性。同时在今后的研究中需进一步完善实验设计，重视实验中的细节如在AP的何阶段给予微生态制剂干预及持续时间，纳入标准及剔除标准需清晰化，并应加大样本量，开展大规模多中心、高质量、双盲、随机对照研究，并做到分层分析，以保证研究的质量。

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(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.015

上海交通大学医工交叉面上项目(YG2015MS29)

200080 上海，上海交通大学附属第一人民医院国际医疗保健中心(刘丽燕)，消化科(王兴鹏、曾悦)

王兴鹏，Email: Richardwangxp@163.com

2015-11-04)