植物乳杆菌B002高密度发酵条件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠，233030

植物乳杆菌B002高密度发酵条件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠，233030

研究了培养基成分(生长因子、碳源、氮源)和培养条件(培养时间、培养温度、接种量、初始pH)对植物乳杆菌B002高密度培养的影响，结果表明，菌体最适培养基条件为：在MRS基础培养基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨；最适的培养条件为：5%接种量、初始pH6.5、37℃培养20 h。培养结束后，菌体密度达到4.71×109cfu/mL。

植物乳杆菌；高密度培养；培养基优化

乳酸菌是对能利用碳水化合物发酵产乳酸等有机酸的革兰氏阳性菌的统称[1]，它能促进肠道蠕动，促进消化[2]，被广泛应用于乳制品行业以及泡菜生产、发酵香肠等。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，兼性厌氧或者厌氧，属于同型发酵乳酸菌，具有促进维生素D的吸收，提高钙、磷的利用率，促进脂类的消化吸收，提高蛋白质的可消化性，缓解乳糖不耐受等作用，可用于发酵饮料、泡菜和肉制品。乳酸菌发酵蔬菜制品，既能赋予蔬菜清新香味，又能保持蔬菜原料脆、嫩、鲜、香的自然风味[3-4]。

高密度发酵是新近发展起来的一种发酵技术,它是生产高质量的浓缩型菌体和代谢产物、实现菌种规模化生产的关键因素[5-6]。本研究以MRS液体培养基为基础，通过单因素试验研究植物乳杆菌B002菌株的培养条件和培养基。在培养基条件单因素试验的基础上，正交优化了植物乳杆菌B002菌株培养基条件，以期提高植物乳杆菌的生长能力和活菌数[7-9]，为制备植物乳杆菌蔬菜发酵专用发酵剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B002，从酸黄瓜中选育，保存于蚌埠学院生物与食品工程系微生物实验室。

1.1.2 主要培养基

10%脱脂乳培养基，MRS肉汤培养基，MRS固体培养基。

1.1.3 主要仪器

BHC-1300ⅡA/B2生物洁净安全柜(苏州净化设备有限公司)，BSD-YX2200立式智能精密摇床(上海恒讯实业有限公司医疗设备厂)，ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，752型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

[2]王学宇．储气井漏磁内检测关键技术研究[D]．武汉：华中科技大学机械科学与工程学院，2013:2-33

[3]杨志军．铁磁性平板腐蚀缺陷多通道漏磁信号的反演与重构[D]．大庆：东北石油大学机械科学与工程学院，2011:5-16

[4]张坚，林春生，陈文须．基于小波滤波与RBF网络的微弱磁场信号检测[J]．兵工自动化，2011，30(7)：64-66

[5]李莺莺．油气管道在线内检测技术若干关键问题研究[D]．天津：天津大学精密仪器与光电子工程学院，2006:1-25

[6]史忠植．神经网络[M]．北京：高等教育出版社，2009：151-153

[7]崔伟，黄松岭，赵伟．基于RBF网络的漏磁检测缺陷定量分析方法[J]．清华大学学报:自然科学版，2006，46(7)：1216-1218, 1222

[8]Technology A．PCI-9114多功能数据采集卡用户使用手册[EB/OL]．(2006-11-16)[2014-01-01]. http://www.adlinktech.com/PD/marketing/Manual/PCI-9114Series/PCI-9114Series_Manual_4.pdf

(责任编辑：汪材印)

1.2 方法1.2.1 种子液的制备

将已活化的植物乳杆菌B002取出摇匀，用微量移液器按1%的量将其移接到MRS液体培养基中，37℃培养12 h。

1.2.2 活菌数测定

采用平板活菌计数法，即用无菌水逐级稀释，选取3个合适的稀释度涂平板，每个稀释度做3次重复，37℃培养24 h，计数。

1.2.3 植物乳杆菌B002高密度发酵的单因素试验

将生长因子、碳源、氮源分别以一定的量添加到MRS基础培养基中，调节不同的培养时间、起始pH、温度、接种量，检测不同的培养条件和培养基对菌体密度的影响。

1.2.4 植物乳杆菌B002高密度发酵的正交试验

由于植物乳杆菌生长要求较复杂，根据单因素试验选择的培养基成分，采用三因素三水平进行正交试验，以确定培养基的最佳方案。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌B002高密度发酵培养条件的选择

2.1.1 生长曲线

为了解植物乳杆菌B002在MRS基础培养基中的生长情况，将菌株在37℃下培养48 h，每隔4 h取出采用稀释涂布法计活菌数。由图1可知，植物乳杆菌B002在经过短暂的4 h的延滞期后，迅速进入对数生长期。在此时期，菌体快速生长繁殖，16 h后，基本进入稳定期生长阶段，在20 h左右，细胞密度达到2.28×109cfu/mL。

图1 植物乳杆菌生长曲线

2.1.2 接种量对菌株生长的影响

将种子液按1%、3%、5%、7%、9% 的接种量接种于MRS基础培养基上，37℃培养20 h，测定活菌数，结果如图2所示。接种量对植物乳杆菌B002高密度发酵有一定的影响，随着接种量的增加，植物乳杆菌B002活菌数呈上升趋势；接种量为5%时，植物乳杆菌B002活菌数达到最高，随后逐渐下降。接种量较少，菌体密度较小；接种量增加，菌体密度相应增加，但营养物质消耗过快，培养后期随着营养物质的消耗，部分菌体会逐渐死亡，所以该菌株的最适接种量为5%。

图2 接种量对菌体密度的影响

2.1.3 培养温度对菌株生长的影响

按5%接种量将种子液接种于MRS基础培养基中，分别放于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下培养20 h，测活菌数，结果如图3所示。微生物在最适生长温度条件下，菌种密度会达到最大值。植物乳杆菌B002的最适生长温度是37℃，在此温度下，生长繁殖最旺盛，所以选择37℃培养该菌株。

图3 培养温度对菌体密度的影响

图4 初始pH值对菌体密度的影响

2.1.4 初始pH值对菌株生长的影响

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调节MRS培养基的起始pH值分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，37℃培养20 h，测定活菌数。pH值是影响微生物生长的主要因素之一，每种微生物都有最适生长的pH值。由图4可知，培养基的初始pH为6.5时，植物乳杆菌B002生长最为旺盛，活菌数较高。初始pH过低或过高，都不利于其生长，因此，该菌株在培养时，初始pH值可以控制在6～7之间。

2.2 植物乳杆菌B002高密度发酵培养基的选择2.2.1 不同生长因子对菌株生长的影响

在MRS液体培养基的基础上，依次添加5%(V/V)的番茄汁、香菇汁、玉米汁、胡萝卜汁和黄瓜汁作为不同的生长因子，按5%接种量，37℃培养20 h，测活菌数，结果如图5所示。植物乳杆菌为生长因子异养型微生物，自身不能合成生长因子[10]，在培养基中添加番茄汁、胡萝卜汁、玉米汁等作为生长因子的供体，可以促进菌种的生长。在几种生长因子中，番茄汁对植物乳杆菌B002的增殖效果最明显，可能是番茄汁作为生长因子能提供一些矿物质、维生素，对其生长繁殖有一定的促进作用。

2.2.2 不同碳源对菌株生长的影响

分别选择葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖4种碳源以2%含量添加到MRS基础培养基中，初始pH值6.5，5%接种量，37℃培养20 h，测活菌数，结果如图6所示。作为微生物生长必需的营养物质之一，碳源不仅是微生物生长的能源物质，也是微生物的组成物质。由图6可以看出，植物乳杆菌B002在以葡萄糖为碳源的培养基中生长较好，菌体密度明显高于含有其他碳源的培养基，因此该菌株的碳源选择葡萄糖。

图5 生长因子对菌体密度的影响

图6 碳源对菌体密度的影响

2.2.3 不同氮源对菌株生长的影响

可以被微生物利用的氮源很多，本实验在MRS基础培养上分别添加2%的胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和硝酸铵作为氮源，结果如图7所示。4种被试氮源中，有机氮源效果好于无机氮源，其中添加胰蛋白胨增菌效果最好，可能是作为有机氮源的胰蛋白胨含有植物乳杆菌B002生长所需要的氨基酸等物质。

图7 氮源对菌体密度的影响

2.2.4 正交试验

通过单因素试验确定正交试验中每种物质的添加量，采用L9(34)三因素三水平正交试验优化培养基配方，结果如表1和表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

由表2中极差R可以看出，影响植物乳杆菌增殖的各因素中，葡萄糖>胰蛋白胨>番茄汁。根据试验结果，确定最佳的培养基配方组合是A2B3C3。

2.2.5 验证性试验

为了验证正交优化组合A2B3C3是否能达到植物乳杆菌B002的高密度培养，将A2B3C3组合与正交表中A2B2C3组合进行对比验证试验，按照正交优化组合A2B3C3的培养基条件，以5%接种量，初始pH6.5，37℃培养20 h，植物乳杆菌B002的活菌数达到4.71×109cfu/mL，高于正交试验表中的所有结果，所以该菌株培养基最佳组合为在MRS基础培养基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨。

3 结束语

以植物乳杆菌B002为出发菌株，优化其高密度培养基和培养条件，最优培养基组合为：在MRS基础培养基中添加番茄汁5%、葡萄糖3%和2.5%胰蛋白胨，在此条件下，初始pH6.5，5%接种量，37℃培养20 h，培养结束后，植物乳杆菌B002菌体密度达到4.71×109cfu/mL。

[1]田菊梅，梁琪，张炎，等．低温乳酸菌混菌培养条件的优化[J]．食品工业科技，2013，34(1)：180-183

[2]阮雁春．乳酸菌高密度培养及浓缩型发酵剂研究[J]．四川烹饪高等专科学校学报，2013(2)：32-34

[3]吴祖芳，翁佩芳，楼佳瑜．乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究[J]．食品与发酵工业，2009，35(10)：5-9

[4]任亚妮，车振明，金建，等．短乳杆菌的培养条件及高密度培养研究[J]．中国调味品，2011，36(6)：48-53

[5]刘彩虹，邵玉宇，任艳，等．高密度发酵和真空冷冻干燥工艺对乳酸菌抗冷冻性的影响[J]．微生物学通报，2013，40(3)：492-499

[6]胡敏，闫辉，杨洁．新疆传统发酵酸乳中屎肠球菌EnterococcusFaecom的高密度培养[J]．中国乳品工业，2012，40(4)：12-17

[7]宋艳，李岳飞，王智鼎，等．嗜酸乳杆菌高密度培养工艺条件的优化及其评价[J]．吉林大学学报:医学版，2013，39(5)：1036-1040

[8]李莹，周剑忠，黄开红．嗜热链球菌蔬菜汁培养基及培养条件的优化[J]．食品工业科技，2007，28(10)：148-150

[9]李言郡，葛红娟，范恩宇，等．德氏乳杆菌WHH009高密度培养条件的研究[J]．中国乳品工业，2013，41(5)：29-32

[10]熊涛，黄锦卿，宋苏华，等．植物乳杆菌发酵培养基的优化及其高密度培养技术[J]．食品科学，2011，32(7)：262-268

(责任编辑：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.03.031

2015-11-25

安徽省高校自然科学研究一般项目“蔬菜发酵专用乳酸菌的选育及其冻干发酵剂的研究”(KJ2013Z194)。

曹珂珂(1980-)，女，安徽界首人，硕士，讲师，主要研究方向：微生物发酵。

Q939.97

A

1673-2006(2016)03-0123-04