取样时间和消毒方法对青钱柳茎段腋芽诱导的影响

王 纪，杨 静， 杨万霞，方升佐*

(1.南京晓庄学院，江苏南京 211171；2.南京林业大学，江苏南京 210037)

取样时间和消毒方法对青钱柳茎段腋芽诱导的影响

王 纪1，杨 静2， 杨万霞2，方升佐2*

(1.南京晓庄学院，江苏南京 211171；2.南京林业大学，江苏南京 210037)

[目的]解决青钱柳组织培养过程中外植体污染问题。[方法]以青钱柳带腋芽的茎段为材料，研究不同取样时间和消毒方法对青钱柳茎段腋芽萌发率的影响。[结果]最佳采样时间为4、5月，最优消毒处理分别为70%乙醇30 s + 0.10%升汞12 min(4月)和70%乙醇30 s + 0.05%升汞16 min(5月)。[结论]试验结果为建立青钱柳的无性快繁体系奠定了基础。

青钱柳；取样时间；消毒；腋芽诱导

青钱柳的组织培养工作已受到众多科研工作者的重视[1]，建立优良的无性系繁殖体系对于保存青钱柳的优质种质资源具有重大意义。通过以芽繁芽的方式增殖，具有取材方便、直接，减少变异，成苗速度快等优点，能保持母树优良性状，并可以克服离体胚培养和愈伤组织再生途径不能保持母本优良特性的缺点[2-5]。但就青钱柳目前的研究情况来看，大部分处于初步探索阶段[6-10]。要建立青钱柳的快繁体系，解决外植体污染问题成为青钱柳腋芽诱导的关键。鉴于此，笔者研究了外植体采样时间和消毒方法对青钱柳茎段腋芽诱导的影响，以期为建立青钱柳的无性快繁体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 南京林业大学校园6年生青钱柳母树当年生嫩枝。

1.2 方法

1.2.1 材料处理及不同消毒方法的筛选。取当年生青钱柳的嫩枝条，剪去叶片，切成2 cm左右的带腋芽茎段，流水冲去表面脏物，再用饱和的洗洁精溶液摇动浸泡5 min，去除外植体表面的尘土和部分菌体，流水冲洗1～2 h，沥水后进行消毒灭菌处理(表1)。各处理完成后，均用无菌水冲洗8～10次，切去两端褐变部分，接种到培养基进行腋芽诱导，每瓶接种2个茎段，每个处理接20瓶。接种后定期观察，及时取出污染茎段，对未污染茎段进行转接。每次接种后20 d统计污染率，30 d统计诱导率。

1.2.2 培养方法。基本培养基均为WPM培养基，附加不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和Vc，蔗糖3.0%，琼脂0.6%，培养基pH调至5.8；121 ℃高压灭菌20 min；培养温度25 ℃；光照强度2 000 lx；光期14 h，暗期10 h；相对湿度50%～70%。

表1 不同消毒方法正交试验设计L4(23)及实施方案

Table 1 Orthogonal design L4(23)and implementary scheme of different disinfection methods

处理号TreatmentNo．试验设计ExperimentaldesignABC实施方案Implementaryscheme70%乙醇处理时间Treatmenttimeof70%alcohol∥s升汞浓度Concentrationofmercuricchloride∥%升汞处理时间TreatmenttimeofmercuricchlorideminM1111150．0512M2122150．1016M3212300．0516M4221300．1012

1.2.3 数据处理。利用Excel软件处理图表；利用DPS数据分析软件进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性检验，判定试验效应的显著性。

污染率=污染茎段数/接种的茎段数×100%

萌芽率=腋芽萌动茎段数/接种的茎段数×100%

2 结果与分析

2.1 取样时间和消毒方法对青钱柳茎段污染率的影响 将处理过的青钱柳外植体接种到培养基中培养，经过一段时间的培养后，4—8月青钱柳茎段外植体污染率最低的分别是M2处理、M3处理、M2处理、M4处理、M2处理，与其他处理间差异都达到极显著水平。12月青钱柳茎段4个消毒处理的污染率均较高，分别达100%、100%、98.00%、92.00%，差异不显著(表2和图1)。

2.2 取样时间和消毒方法对青钱柳茎段腋芽诱导率的影响 由表3可知，4—7月青钱柳茎段都有萌芽的能力，4月腋芽诱导率最高的是M1处理，达51.43%，其次是M2、M4处理，两者萌芽率差异不显著；而8月以后的茎段腋芽诱导率为0，这可能是8月以后的青钱柳茎段已经木质化，体内激素水平也不再适合腋芽的诱导。青钱柳茎段最好的消毒处理是M2，其次是M1。综合各月的最高萌芽率可以看出，随着月份的增加，青钱柳茎段腋芽的萌发率逐渐下降，以4月的萌芽率最高，5、6月差异不显著，但较4月的腋芽诱导率降低，7月腋芽诱导率降低达到显著水平，8月以后的茎段腋芽诱导率降为0。而污染率则是随着月份的增加而提高，从4月的11.36%～44.44%增加到7月的66.07%～83.61%。分析可知，不同月份的青钱柳茎段要采用不同的消毒方法，取样时间以4—7月为宜，最佳采样时间为4、5月(图2)。

表2 取样时间和消毒处理对青钱柳茎段污染率的影响

注：同列数据后不同大、小字母分别表示不同处理间在0.01、0.05水平差异显著。

Note：Different capital letters and lowercases at the same column indicated that there was significant difference at 0.01 and 0.05 level，respectively.

图1 青钱柳茎段灭菌后不同类型的污染 Fig.1 Different pollution on disinfect stem of Cyclocarya paliurus

%

注：同列数据后不同大、小字母分别表示不同处理间在0.01、0.05水平差异显著。

Note：Different capital letters and lowercases at the same column indicated that there was significant difference at 0.01 and 0.05 level，respectively.

注：a.4月青钱柳腋芽诱导；b.5月青钱柳腋芽诱导；c.6月青钱柳腋芽诱导；d.青钱柳茎段诱导出双芽。Note：a.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in April；b.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in May；c.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in June；d.Double bud induced from bud of Cyclocarya paliurus.图2 青钱柳茎段腋芽诱导Fig.2 Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus

2.3 不同月份青钱柳茎段消毒方法筛选 通过对青钱柳茎段各月污染率的极差分析(表4、5)，得到每月的最优消毒处理分别为，4月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞12 min(M4)；5月：70%乙醇30 s + 0.05%升汞16 min(M3)；6月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞16 min；7月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞12 min(M4)；这些处理并未全部包括在已设计的正交试验中，所以以后的试验可以参考上述结果再做调整。从极差分析结果还可看出，4、7月乙醇消毒时间对污染率影响最大，5、6、8月升汞浓度对污染率影响最大。而对不同取样时间腋芽诱导率影响的主要因素也不同，4月对腋芽诱导率影响最大的是乙醇处理时间，5、7月是升汞浓度，6月对青钱柳腋芽诱导率影响最大的是升汞处理时间。

表4 取样时间和消毒处理青钱柳茎段腋芽诱导率极差分析

表5 取样时间和消毒处理青钱柳茎段污染率极差分析

3 结论与讨论

青钱柳组织培养成功，其外植体的取样和消毒是基础和关键的一步。在青钱柳消毒试验和腋芽诱导的组织培养过程中，细菌性污染和真菌性污染都有出现[11-13]。该研究表明，对于材料表面的污染，通过不同浓度的乙醇和升汞即可控制，而对于外植体内源菌的污染，可以尝试在以后的诱导培养基中加入适当的消毒剂，以减少内源菌带来的污染。另外，也可通过取样时间的控制来减少外植体的内源菌携带。一般选择4—6月青钱柳新抽出来枝条进行试验，且采样还应该选择晴朗天气中午阳光较强时，此时的材料带菌较少。

该试验结果表明，污染率是随着月份的增加而提高，从4月的11.36%～44.44%增加到7月的66.07%～83.61%，12月的污染率能达100%。而从各月份的最高萌芽率可以看出，随着月份的增加，青钱柳茎段腋芽的萌发率逐渐下降，以4月最高，8月以后的茎段腋芽萌发率降为0。污染率和萌芽率要求的消毒条件是互相矛盾的，低污染要求较高浓度和较长时间的乙醇和升汞处理，而高萌芽率则与该要求相反，需要低浓度和较短时间的乙醇和升汞处理。因此，消毒剂的浓度水平、消毒时间和取样时间的选择可以进一步优化组合，为青钱柳的组织培养提供更合适的消毒方法。

另外，随着人们对环境污染的重视，升汞作为一种重金属物质且有毒，后续试验可以考虑将其替换成次氯酸钠、吐温等消毒剂[14-16]。

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Effects of Sampling Time and Disinfection Methods on Axillary Bud Induction ofCyclocaryapaliurus

WANG Ji1, YANG Jing2, YANG Wan-xia2, FANG Sheng-zuo2*

(1. Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing, Jiangsu 211171; 2. Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037)

[Objective] The aim was to solve the problem of explants pollution in tissue culture ofCyclocaryapaliurus. [Method] Axillary bud from stem segments ofCyclocaryapaliuruswere used as explants, and the effects sampling time and disinfection methods on axillary bud induction ofCyclocaryapaliuruswere studied. [Result] The best sampling time was April and May, 70% alcohol 30 s+0.10% mercuric chloride 12 min for April and 70% alcohol 30 s+0.05% mercuric chloride 16 min for May. [Conclusion] The results lay the basis for establishing asexual micropropagation system ofCyclocaryapaliurus.

Cyclocaryapaliurus; Sampling time; Disinfection methods; Axillary bud induction

国家自然科学基金项目(31270673)；南京晓庄学院青年专项(2015NXY76)。

王纪(1981- )，女，河南商水人，实验师，博士，从事植物组织培养研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事人工林培育研究。

2016-10-26

S 723.1

A

0517-6611(2016)34-0154-03