冠通方对兔心肌缺血再灌注心肌细胞超微结构的影响

王 强 韦 斌何劲松 陈广琴 广西中医药大学附属瑞康医院 530011 南宁市华东路10号

姜 浩 广西中医药大学第一附属医院 530023

尹 玮 广西中医药大学2013级硕士研究生 530001

骆 虹 广西中医药大学2014级硕士研究生 530001

冠通方对兔心肌缺血再灌注心肌细胞超微结构的影响

王 强 韦 斌*何劲松 陈广琴 广西中医药大学附属瑞康医院 530011 南宁市华东路10号

姜 浩 广西中医药大学第一附属医院 530023

尹 玮 广西中医药大学2013级硕士研究生 530001

骆 虹 广西中医药大学2014级硕士研究生 530001

目的：观察冠通方对兔心肌缺血再灌注后心肌细胞超微结构的影响。方法：将48只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为假手术组、模型对照组、复方丹参滴丸对照组、冠通方大剂量组、冠通方中剂量组、冠通方小剂量组，每组各8只，分别灌胃给药14 d。实验结束后取心肌标本行透射电镜观察心肌细胞超微结构。结果：缺血再灌注模型组心肌细胞超微结构受到破坏，肌原纤维断裂、溶解，肌原纤维排列混乱；线粒体水肿、线粒体内嵴断裂紊乱，线粒体肿胀呈近似圆形。复方丹参滴丸组，冠通方大、中剂量组心肌细胞超微结构形态较好，肌丝排列整齐，肌节明暗带清晰可见，大部分线粒体外膜清晰完整，线粒体内嵴排列较规整，基质颗粒较多，部分肌丝出现断裂，但多数肌原纤维条纹清晰，核仁明显。结论：冠通方大、中剂量组可以明显减轻缺血再灌注时心肌细胞结构的损害，可以有效防止缺血再灌注后心肌细胞的凋亡，从而达到保护心肌细胞的作用。

冠通方；心肌细胞；缺血再灌注；超微结构；实验研究

心肌缺血－再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指在心肌细胞缺血的基础上，恢复心脏血液再灌注后，心肌细胞发生的功能障碍和结构损伤。临床上，当阻塞的动脉血管经PCI术后再通，心肌细胞可重新获得血液灌注，但在改善心肌血液循环和血氧供给的同时常常会出现缺血再灌注后心肌功能障碍与心肌细胞的损伤。中医中药可能对防治心肌缺血再灌注损伤发挥重要作用。本研究通过动物实验观察中药冠通方干预心脏再灌注损伤后心肌细胞的超微结构病理变化，了解冠通方对心肌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组 新西兰大白兔48只，体重在2.5～3 kg，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（桂）2011－0003。兔适应性饲养1周后按随机数字表法随机分为A、B、C、D、E、F等6组，每组8只。A组为假手术组，B组为模型对照组，C组为阳性对照组（复方丹参滴丸组），D组为冠通方大剂量组，E组为冠通方中剂量组，F组为冠通方小剂量组。

1.2 造模方法 经耳缘静脉注射戊巴比妥钠30 mg·kg－1后，将兔背位固定，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图。颈部正中切开皮肤，钝性分离颈前肌，切开气管，插入Y型气管插管，连接微型人工呼吸机（潮气量10～15 ml/kg，频率40次/分）。沿胸骨左缘3～4肋间隙开胸，暴露心脏。采用5－0线结扎冠状动脉左前降支（LAD）法制备心肌缺血再灌注模型，为避免实验动物心梗面积过大导致死亡，冠状动脉阻断点应在冠状动脉左前降支发向下发出约5－10 mm处选择结扎位点，以心电图出现ST段弓背抬高和结扎线以下心肌组织颜色变暗、局部节段性运动不良为结扎成功。待结扎40 min后剪断手术线实现再灌注，灌注时间为2 h。以缺血区转红并反应性充血、收缩活动逐渐恢复、ST段恢复1/2以上为再灌注成功。假手术组只穿线不结扎，余操作同上。

1.3 试验药物及给药方法 冠通方药物组成及剂量如下：三七45 g，生晒参100 g，丹参150 g，地龙150 g，全瓜蒌150 g，麦冬150 g，绞股蓝150 g，陈皮100 g。冠通方由广西中医药大学制药厂按上述配方制成颗粒剂（每包含生药4 g），分装规格为每包3.5 g。复方丹参滴丸由天津天士力制药股份有限公司生产，国药准字Z10950111，每粒27 mg，批号101210。根据人兔临床用药剂量换算公式换算成兔用药量［1］。C组灌胃丹参滴丸54 mg/（kg·d），D组灌胃冠通方3.6 g/（kg·d），E组灌胃冠通方1.8 g/（kg·d），F组灌胃冠通方0.9 g/（kg·d）。兔分笼饲养，自由饮食，于每天早上8点灌胃给药，假手术组和模型对照组予蒸馏水灌胃。各组均给药14 d，末次给药1 h后进行标本采集。

1.4 标本处理及检测 实验结束后，处死兔子，剪下心脏，取左心室心肌缺血区心肌切成约2 mm× 1 mm×1 mm的条状小块，将心肌组织放入2.5%戊二醛固定过夜，用0.1 M、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min，经磷酸缓冲液冲洗后，再用1%锇酸后固定1h，用梯度浓度（包括50%、70%、80%、90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的无水乙醇处理2次，每次20 min。环氧树脂Epon－812包埋剂包埋，超薄切片机切片，片厚70 nm，3%醋酸铀－枸橼酸铅双染色后，用H－7650日立透射电子显微镜观察，主要观察指标：心肌细胞肌纤维、线粒体等。

2 检测结果

假手术组心肌细胞内肌原纤维纹理清晰，肌丝结构完整，排列规则，肌原纤维的明带和暗带中粗细纤维清晰可见；细胞核呈规则圆形，细胞核内染色质分布均匀，线粒体嵴排列紧密，结构形态完整，肌浆网无充盈无肿胀（见图1－A）。

模型对照组心肌细胞肌原纤维纹理出现紊乱，肌丝结构松散，部分心肌原纤维出现损害，心肌原纤维溶解或撕裂，闰盘结构不完整，肌浆网扩张；心肌细胞内线粒体内基质颗粒减少，线粒体膜部分断裂，内质网扩大，类似空泡样变。细胞核外形不规则，核膜边缘溶解，或褶皱变形，呈现齿状或指状突起，核质杂乱，核仁溶解消失（见图1－B）。

复方丹参滴丸对照组心肌细胞内大部分心肌原纤维排列整齐，线粒体形态完整，大部分线粒体无明显肿胀，线粒体内嵴的排列规则，嵴较多，少部分心肌原纤维紊乱（见图1－C）。

冠通方大剂量组心肌细胞内大部分心肌原纤维排列整齐，线粒体形态完整，大部分线粒体无明显肿胀，线粒体内嵴的排列规则，内嵴上基质颗粒较多，少部分心肌原纤维紊乱（见图1－D）。

冠通方中剂量组心肌原纤维和线粒体形态与冠通方大剂量组的基本结构类似，心肌细胞内大部分心肌原纤维排列整齐，大部分线粒体形态完整，无明显肿胀，线粒体内嵴的排列规则，线粒体内基质颗粒较多，少部分心肌原纤维紊乱（见图1－E）。

冠通方小剂量组心肌细胞内少部分心肌线粒体内部结构较完整，大部分线粒体内嵴排列紊乱，出现嵴断裂，基质颗粒减少，线粒体轻度肿胀呈圆形，细胞内可出现空泡样变（见图1－F）。

3 讨论

缺血再灌注损伤的发生可能与钙超载、氧自由基增多、心肌纤维能量代谢障碍、炎症反应、酸中毒等机制有关。心肌缺血缺氧再灌注后，心肌细胞内线粒体内嵴受到损伤，并出现线粒体功能障碍，心肌细胞能量供给异常；同时心肌细胞膜通透性增高，膜泵功能失调，可以导致心肌细胞内发生结构变化甚至变性、坏死或凋亡。同时缺血及再灌注后引起大量氧自由基产生，心肌细胞代谢产物堆积、不能被清除，从而破坏细胞膜的稳定性，导致心肌细胞损害［2］。

冠通方方中三七、丹参、地龙活血化瘀，消肿止痛；瓜蒌清热化痰；生晒参能补益脾气；绞股蓝益气养阴，消热解毒；麦冬能清热养阴生津；陈皮能行气燥湿化痰。诸药合用则具有益气养阴、清热解毒化痰、行气活血化瘀通络之功［3］。方中君药三七是广西的特色药材之一，现代药理研究表明三七的主要成分是三七总皂苷（PNS），PNS有良好的抗氧化作用，能抵抗自由基对心肌缺血再灌注后导致的心肌细胞损伤［4］。顾国嵘等［5－6］通过酶学、形态学、免疫组织化学等研究表明，PNS能明显减少缺血再灌流导致的心肌细胞坏死和凋亡，对缺血再灌流心肌起到延迟保护作用。生晒参和绞股蓝都有一定的抗氧化作用。丹参能清除自由基，其成分中的丹参酮类、丹参素、丹酚酸类化合物、原儿茶醛、咖啡酸及迷迭香酸均具有很强的抗氧化作用。王庆高等［7］研究以丹参为主药的中药制剂，发现其可以抑制炎症反应而减少心肌缺血再灌注损伤。丹参有效成分丹参酮ⅡA可抑制细胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高SOD的活性，清除氧自由基并抑制脂质过氧化反应，保护血管内皮细胞［8－9］。

图1 各组兔心肌细胞超微结构比较

本研究结果表明，心肌缺血再灌注可损伤心肌细胞结构，表现为线粒体不规则变形、线粒体肿胀、线粒体内嵴排列紊乱、基质颗粒减少或消失等变化，可见线粒体由正常的椭圆形逐渐变圆形、基质颗粒减少。已有研究表明复方丹参滴丸［10－11］可以减轻心肌缺血再灌注损伤，对心肌细胞有保护作用，本研究结果与此类似。冠通方大剂量组、冠通方中剂量组心肌超微结构中线粒体内嵴排列较整齐、基质颗粒无明显减少；大部分肌原纤维排列整齐，肌丝无明显断裂，与复方丹参滴丸作用相似。这一结果可为临床应用冠通方抗心肌缺血、改善心肌缺血再灌注损伤提供实验依据。

［1］陈奇.中药药理研究方法学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2006：1167－1170.

［2］董六一，陈志武.心肌缺血/再灌注损伤与炎症反应［J］.中国临床药理学与治疗学，2008，13（5）：582－588.

［3］王强，韦斌，姜浩，等.冠通方对大鼠心肌缺血/再灌注损伤心肌组织IL－8和IL－10蛋白表达的影响［J］.广西中医药，2015，38（5）：57－60.

［4］殷昌青，邓海山，程健.三七对血液、心脑血管和中枢神经系统的药理作用研究概述［J］.科技信息，2010（29）：50－51.

［5］顾国嵘，黄培志，葛均波，等.缺血及三七总皂苷预处理对心肌缺血一再灌流损伤的保护作用［J］.中华急诊医学杂志，2005，14（4）：307－309.

［6］陈立波，佟力，赵洪序，等.人参总皂甙对心肌缺血再灌注损伤的保护作用实验研究［J］.中华胸心血管外科杂志，1994，10（4）：353－354.

［7］王庆高，卢健棋，李成林，等.扶芳藤丹参合剂预处理对AS大鼠心肌缺血再灌注损伤中TNF－α及NF－κB的影响［J］.广西中医药大学学报，2013，16（2）：9－11.

［8］韩畅，王孝铭，张国义.丹参对心肌缺血和再灌注损伤的保护作用［J］.中国病理生理杂志，1991，7（4）：337－341.

［9］杨志霞，林谦，马利.丹参对心血管疾病药理作用的文献研究［J］.世界中西医结合杂志，2012，7（2）：93－96.

［10］刘明洁，孙旗，王强，等.蓝萼香茶菜总二萜预处理对兔心肌缺血/再灌注时心肌细胞凋亡的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：229－233.

［11］邹纯才，魏美玲，鄢海燕，等.瓜蒌薤白滴丸抗心肌缺血再灌注损伤作用［J］.国际药学研究杂志，2016，43（5）：926－930.

（2016－11－15收稿/编辑 刘 强）

R541.4

A

1003-0719（2016）06-0071-03

国家自然科学基金项目（项目批准号：81160436）

*通信作者，E－mail：120771597＠qq.com