2014～2015年黑龙江牡丹江地区犬博卡病毒的分子流行病学调查

姚爽，王志慧，滕井胜，李春秋，张思瑶，边秀东，张立春，郭东华

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江农业经济职业学院）

2014～2015年黑龙江牡丹江地区犬博卡病毒的分子流行病学调查

姚爽1，王志慧1，滕井胜2，李春秋1，张思瑶1，边秀东1，张立春1，郭东华1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江农业经济职业学院）

为了调查黑龙江牡丹江地区犬博卡病毒流行情况，在2014年5月至2015年4月，在黑龙江牡丹江地区采集40份腹泻犬的粪便拭子样品，利用PCR扩增方法进行鉴定和混合感染检测，进一步做进化树进行分析。检测结果显示，在40份样品中，8份样品为CBoV阳性（20%，8/40）；在8份CBoV阳性样品中，与CPV-2、CCoV、CaKV混合感染率分别为37.3%（3/8）、25%（2/8）、25%（2/8）。序列分析表明，8个CBoV毒株的NS1片段在核苷酸水平的同源性为94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性为91.7%～100%。进化树分析显示，与韩国、美国、德国和中国香港的CBoV毒株相比，8个中国CBoV毒株表现出遗传多样性。研究揭示了黑龙江牡丹江地区流行的CBoV毒株显示出遗传多样性以及与其他肠道病毒的混合感染情况。

犬博卡病毒；混合感染；遗传多样性

博卡病毒（Bocaviruses）具有广泛的哺乳动物宿主范围，包括人、牛、猪、大猩猩、黑猩猩、加利福尼亚海狮、犬、猫、蝙蝠和貂鼠[1-10]。博卡属于细小病毒亚科（Parvovrinae），存在特殊的含有第三个开放阅读框（ORF）NP1，博卡病毒基因组大小约5 kb左右，为单链线性DNA，编码非结构蛋白和衣壳蛋白。博卡病毒能引起严重的下呼吸道感染和胃肠道症状，是人和多种动物病毒性腹泻的主要致病因素。大量研究显示，在猪、犬、猫中鉴定了新型动物博卡病毒，具有不同的遗传进化特性[6-7，10]。这些研究结果提示，不同宿主来源的博卡病毒也许具有高度的遗传多样性。因此，博卡病毒的分子流行病学调查，对该病毒遗传演化的理解具有重要的意义。

在中国，人和猪的博卡病毒感染及遗传演化已经被报道[11-14]。然而，犬博卡病毒（canine bocavirus，CBoV）在中国流行情况和遗传演化仍然不清楚，进化分析是研究物种间亲缘关系的一种方法[15]。鉴于此，研究对CBoV NS1基因片段进行PCR扩增，对黑龙江牡丹江地区腹泻犬粪便样品的CBoV感染情况进行调查，进一步进行了进化性分析。研究的目的旨在揭示黑龙江牡丹江地区CBoV感染情况及遗传演化特性，增加CBoV分子流行病学信息，为CBoV致病性相关研究提供基础信息。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

采样管（3.5 mL）购自北京友康生物科技有限公司，基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，PCR预混酶、琼脂糖（Agarose）、DNA Marker DL2000均购自TaKaRa公司，axyprep胶回收试剂盒购自吴江康宁生命科学有限公司。

1.2 样品采集

2014年5月至2015年4月，利用病毒采样管在黑龙江牡丹江地区某宠物医院收集腹泻犬的粪便拭子样品，总计40份。将40份粪便拭子样品按顺序（1～40）标记并分装出1 mL，保存于-80℃冰箱备用。

1.3 NS1基因的引物设计

研究利用DNAMAN 6.0软件，对Genbank中6 个CBoV病毒株（GenBank登录号分别为JN648103、JQ692588、JQ692589、JQ692590、JQ692591和KF77-1828）的NS1基因序列进行多重序列比对分析，确定NS1基因保守区。根据GenBank中发布的CBoV全基 因 组 病 毒 株 HK880N（GenBank登 录 号JQ692588），利用Primer 5.0引物设计软件，根据NS1基因保守区，设计一对特异性引物，NS1-F：5' CTTCAGATGGTTCACATTAAGAT 3'（1 244 nt～1 266 nt），NS1-R：5'GGCAGYAGCTGAGAGTCTTT 3'（1 664 nt～1 683 nt），扩增的目的片段大小为440 bp。引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

1.4 NS1基因的序列分析

取200 μL粪便拭子样品按照北京天根生化科技有限公司基因组提取试剂盒说明书提取病毒DNA。并以提取的DNA样品为模板，按照50 μL体系进行PCR扩增：0.1 μM上游引物、0.1 μM下游引物、4 μL基因组DNA、25 μL PCR 2×Premix预混酶，用灭菌超纯水补足50 μL。PCR扩增条件为：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃再延伸10 min，置4℃保存。然后将PCR阳性产物用axyprep胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物使用Sanger方法测序，每个样品重复三次。将所有序列递交NCBI的Genbank数据库，它们的编号如下：KR998480、KR998481、KR998482、KR998483、KR998484、KR998485、KR998486和KR998487。

1.5 NS1基因的进化树分析

为了分析鉴定的CBoV毒株NS1基因分子进化性，在Genbank中选取发表的CBoV NS1基因作为参考序列，利用MEGA 6.06软件NJ法构建进化树[16]。参考毒株的 Genbank登录号如下：KP281715、KP281716、KP281717、KP281718、KP281719、KP281720、JQ692588、JQ692589、JQ692590、JQ692591、KF771828、JN648103、KC580640和AF495467。

1.6 其他犬肠道病毒的检测

利用PCR或RT-PCR的方法筛查CBoV阳性样品中犬细小病毒2型（CPV-2）、犬冠状病毒（CCoV）、犬星状病毒（CaAstV）、犬诺瓦克病毒（CNoV）、犬嵴病毒（CaKV）和轮状病毒A型（RV-A）的感染情况，从而获得CBoV与其他犬肠道病原体的混合感染情况。

2 结果

2.1 CBoV的PCR检测

以CBoV的NS1基因为靶基因，通过PCR方法，对黑龙江牡丹江地区40份犬腹泻粪便样品进行了检测与分析。PCR检测结果显示，40份犬腹泻粪便样品中有8株CBoV阳性，阳性率为20%。8株CBoV阳性样品中，CPV-2的阳性率为37.3%（3/8），CCoV阳性率为25%（2/8），CaKV阳性率为25%（1/8）。序列分析显示，8个CBoV毒株的NS1片段在核苷酸水平的同源性为94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性为91.7%～100%。

2.2 CBoV毒株进化树分析

利用MEGA 6.06软件对研究鉴定的8株CBoV NS1基因片段（440 bp）分子进化树进行了分析。结果显示，MDJ-15、MDJ-27、MDJ-21、MDJ-23形成一个单独的亚群，MDJ-26、MDJ-17、MDJ-12、MDJ-13与韩国、香港、德国、美国参考株在一个分支上，其中MDJ-12、MDJ-13亲缘关系很近，聚在一个单独的分支上，MDJ-17、MDJ-26与韩国、香港、德国、美国参考株亲缘关系较近，其中以与香港参考株关系为最近（图1）。

表1 牡丹江地区CBoV毒株信息Table 1 Characteristics of the CBoV strains identified in Mudanjiang area

图1 CBoV NS1基因进化树分析Fig.1 Evolutionary tree analysis of CBoV NS1 gene

3 讨论

在过去几年中，不同的博卡病毒毒株在动物和人中的鉴定，在世界范围内引起了广泛关注。在研究中，黑龙江牡丹江地区采集的患有腹泻症状的40份犬粪便样品中，CBoV的阳性率为20%，高于之前Lau 等[6]报道的4.6%。通过与其他犬肠道病原体的筛查发现，在8份CBoV阳性样品中，CPV-2阳性率为37.3%（3/8），CCoV阳性率为25%（2/8），CaKV阳性率为25%（2/8）。可见CBoV与其他犬肠道病原体有较高的混合感染情况，推测CBoV可能多以混合感染的形式致病。研究的数据提示CBoV作为一个潜在的肠道病原体可能与犬的病毒性腹泻密切相关。

最近，新型博卡病毒株已经在猫和犬中被报道[6，17]，在研究中，牡丹江地区8个CBoV毒株NS1基因序列分析表明，8株CBoV毒株NS1片段在核苷酸水平的同源性为94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性为91.7%～100%。进一步进化树分析显示，8株CBoV毒株在进化树中被划分到不同的分支，表现出遗传多样性。牡丹江地区CBoV毒株遗传演化分析结果提示，CBoV在腹泻犬粪便中可能以多种基因型存在。为了明确CBoV遗传演化情况，CBoV广泛的流行病学调查与监测是十分必要的。Bodewes等人[17]报道在健康犬体内也能检测到博卡病毒的存在，可见该病可能存在致病性上的差异，也可能与犬只日龄不同，抵抗力不同有关，这需要进一步的研究确证。

4 结论

黑龙江省牡丹江地区腹泻犬中CBoV毒株表现出遗传多样性，CBoV阳性犬粪便中存在CPV-2、CCoV和CaKV混合感染。

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Molecular Epidemiology Investigation of Canine Bocavirus in Mudanjiang Area of Heilongjiang Province from 2014 to 2015

Yao Shuang1，Wang Zhihui1，Teng Jingsheng2，Li Chunqiu1，Zhang Siyao1，Bian Xiudong1，Zhang Lichun1，Guo Donghua1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Agricultural Economy Vocational College）

To investigate the evolution of CBoV strains circulating in Northeast China，40 fecal samples from rectal swabs of diarrheic dogs collected from May 2014 to April 2015 in Mudanjiang area.PCR amplification method was used to identify co-infection detection and phylogenetic analysis.The PCR results indicated that 8 of the 40 fecal samples（20%）were positive for CBoV，co-infction of CPV-2，CCoV，and CaKV was 37.3%，25%，and 25%，respectively.Sequence analysis revealed that the partial NS1 genes of the 8 CBoV strains exhibited 94.2%～100%nucleotide identity，and 91.7%～100%amino acid identity.Phylogenetic analysis revealed that genetic diversity of the 8 CBoV strains from China compared with strains of CBoV from South Korea，the USA，Germany，and Hong Kong of China.The data revealed the presence of co-infection and genetic groups among the CBoV strains circulating in Mudanjiang area.

canine bocaviruses；co-infection；genetic diversity

S852.655

A

1002-2090（2016）05-0047-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.009

2016-03-19

黑龙江八一农垦大学研究生创新项目（YJSCX2015-Y28）。

姚爽（1991-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

郭东华，女，教授，硕士研究生导师，E-mail：dh_guo@126.com。