检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

栾云艳，林红丽，侯喜林

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

栾云艳，林红丽，侯喜林

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为检测牛奶中的布鲁氏菌，通过对布鲁氏菌外膜蛋白31 kDa的一段基因进行套式PCR扩增，建立从临床奶样中检测布鲁氏菌的方法。改进了奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法，通过正交试验的方法优化了套式PCR试验的反应条件，优化后的一扩PCR反应条件为：退火温度56.4℃，Mg2+浓度1.5 mM，rTaq酶0.2 μL，引物0.3 μM，dNTP浓度0.2 mM；二扩PCR反应条件为：退火温度53.3℃，Mg2+浓度1.5 mM，rTaq酶0.25 μL，引物0.4 μM，dNTP浓度0.1 mM。其敏感性为8 CFU·mL-1，比细菌分离试验敏感1 000倍；与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌均无交叉反应；与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%，阴性符合率是86.36%。试验建立的套式PCR方法可用于检测奶样中布鲁氏菌。

布鲁氏菌；套式PCR；奶样；奶牛

布鲁氏菌病（Brucellosis）于1859年由Morston首次报道[1]，是目前世界上流行最广、危害最大的人兽共患病之一[2]，给世界的畜牧业以及人类的健康带来巨大的威胁，世界动物卫生组织（OIE）已将其列为需要通报的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病[3]。

传统的诊断方法有很多，包括平板凝集反应、试管凝集反应、补体结合反应[4]等，上述方法均可检测布鲁氏菌病，而且操作较方便，但是敏感性不理想，实际临床操作时往往需要多种方法结合应用[9]。PCR技术[10]是快速、敏感的病原学诊断技术，成为近年来的研究热点。自1990年，Fekete等[5]最早利用PCR的方法扩增了布鲁氏菌S19菌株的43 kDa蛋白的基因，并证实了他们研究的这种PCR方法扩增布鲁氏菌外膜蛋白基因的特异性和敏感性以来，国内外便有很多关于PCR方法的报道。2001年，Amin[15]等人用PCR方法对牛羊的精液样品进行了检测，证实了PCR方法远比常规细菌分离技术敏感而快速；2007年，Stella Mitka等[14]通过用PCR的方法与细菌分离试验、血清凝集试验、补体结合试验进行比较，证实了PCR方法已经有超高的敏感性和特异性，并得出PCR是一种很有用的快速的检测工具的结论。2008年，国内的曹小安等[16]建立了检测牛精液中布鲁氏菌套氏聚合酶链式反应检测方法，该方法能够应用于感染布鲁氏菌病后的病原分子生物学诊断。研究拟建立一种快速、准确的诊断患病牛奶样中布鲁氏菌病的套氏PCR方法，为在实际生产中通过检测奶样中布鲁氏菌诊断布病奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

试验菌株为S2型猪布鲁氏菌疫苗株，购自内蒙古金宇保灵生物药品有限公司；参考菌株为牛布鲁氏菌ha-1株，为实验室分离自流产牛并鉴定保存。

1.2 主要试剂

rTaq DNA聚合酶、TaKaRa dNTPs、Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司、MERCK蛋白酶K，Sigma RNase A酶，琼脂粉购自Spanish公司、CTAB/Na－Cl，SDS，葡萄糖，NET缓冲液，酚/氯仿/异戊醇以及其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.3 布鲁氏菌基因组的提取

参照邱昌庆[6]和杜振昆[7]报道的方法，应用CTAB/NaCl方法，并在此基础上加以改进。提取布鲁氏菌基因组[8]。

1.4 引物的设计与合成

根据布鲁氏菌的外膜蛋白（OMP）31 ku基因设计套氏PCR的引物，由北京华大基因科技技术有限公司合成，引物的序列如下：第一套引物，OMP1：5'-CTATGGCTGCCGACGTGGTTGTTT-3'，OMP2：5'-CG GTGTAGAGGTATTCCGACTTGAGC-3'，一扩后产物的预期片段大小为681 bp；第二套引物：OMP3：5'-GACAAGGAAGACAACGA-3'，OMP4：5'-ATGGCATA TTCAGCACC-3'，二扩后产物的预期片段大小是416 bp。

1.5 套式PCR扩增体系的优化及循环参数

选择正交试验的方法，对套氏PCR的反应条件进行优化，正交实验要素如下表：

表1 一扩PCR反应体系正交试验6因素5水平表Table 1 6 factors 5 levels of orthogonal test for the first PCR reaction system

表2 二扩PCR反应体系正交试验6因素5水平表Table 2 6 factors 5 levels of orthogonal test for the second PCR reaction system

根据以上两个正交试验的6因素5水平表格，可以设计出一个含有25组试验的试验方案，每组试验都是不同因素不同水平的组合，套氏PCR的反应参数如下：

一扩反应体系采用25 μL体系，循环参数为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

二扩反应体系采用25 μL反应体系，循环参数为：95℃预变性5 min，94℃变性30 min，退火1 min，72℃延伸1 min，20个循环，最后72℃延伸6 min。

分别取4 μL上样进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察扩增结果。

1.6 敏感性试验

对菌液进行细菌计数，确定细菌数为8× 106CFU·mL-1，然后利用奶样对菌液进行10倍连续稀释，分别取1 mL进行基因组DNA提取和套式PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪检测扩增结果。

1.7 特异性试验

对混有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌的奶样与布鲁氏菌参考菌株ha-1株奶样一同进行DNA提取，并用上述最优的套式PCR方法进行扩增，确定方法的特异性。

1.8 套式PCR方法与其他方法的符合性试验

1.8.1 与细菌分离的符合性试验

将菌液8×106CFU·mL-1用奶样进行10倍连续稀释后，分别取1 mL奶样进行套式PCR检测和细菌分离鉴定，细菌分离具体操作为：取1 mL带菌奶样于离心管中，10 000 rpm·min-1离心10 min，弃上清，取100 μL生理盐水重悬沉淀，将混合物均匀涂于胰蛋白胨琼脂平板上，放置37℃恒温培养箱中培养24 h，挑取单菌落制成抹片，用柯兹罗夫斯基染色法染色，镜检。

1.8.2 与试管凝集试验的符合性试验

实验室低温保存的采集自牛场的奶样共60份，每份奶样在采集时与之相对应的血清样品做了试管凝集试验，其中有38份血清样品的试管凝集试验的结果为阳性，22份血清样品的试管凝集试验结果为阴性。将60份奶样分别提取基因组，用研究中的套氏PCR进行检测，最后查看试管凝集试验和套氏PCR的符合性。

2 结果

2.1 PCR条件优化结果

2.1.1 套氏PCR一扩反应体系优化结果

0.156 5 Hz的状态是直线塔和导、地线发生耦合振动,共振频率为0.305 9 Hz，是耐张塔和导、地线发生耦合振动.与单塔模态分析的共振频率相比,体系的耦合振动频率明显小很多.在对单塔的模态振动分析时,在前10阶中没有出现单塔的垂直向共振,说明在单塔模态时的垂直向1阶共振频率要高于水平向的2阶共振频率,但从塔-线体的耦合振动分析可以看出(见表3),垂直向的模态频率为0.858 6 Hz时是小于2阶横向共振频率0.958 8 Hz.由此说明,与单塔模态频率相比,塔-线体系中单塔的垂直向共振频率值比水平向共振频率值降低得多.

由图1试验结果可以看出，第15组的目的条带最亮，因此，选取第15组的PCR条件作为一扩反应最优的PCR反应条件，即退火温度是56.4℃，Mg2+浓度是1.5 mM，酶是0.2 μL，引物是0.3 μM，dNTP浓度是0.2 mM。

图1 套氏PCR一扩反应条件优化结果Fig.1 The optimization PCR condition for the first primer sets

2.1.2 套氏PCR二扩反应体系优化结果

由图2试验结果可以看出，第19组目的条带最亮，因此，选取第19组的PCR条件作为二扩反应最优的PCR反应条件，即退火温度是53.3℃，Mg2+浓度是1.5 mM，酶是0.25 μL，引物是0.4 μM，dNTP浓度是0.1 mM。

图2 套氏PCR二扩反应条件优化结果Fig.2 The optimization PCR condition for the second primer sets

2.2 敏感性试验结果

应用上述最优的套式PCR方法进行的敏感性试验检测布鲁氏菌的最少菌数为8 CFU·mL-1，结果见图3。结果，当再加大稀释倍数则不能检测出阳性结果，而套式PCR的方法则能在奶样被106倍稀释时，即菌数为8 CFU·mL-1时，检测出阳性结果，结果表明套式PCR检测布鲁氏菌比细菌分离方法敏感性高1 000倍。

图3 套式PCR敏感性检测Fig.3 Sensitivity test for the nested-PCR

2.3 特异性试验结果

2.4 与细菌分离的符合性试验结果

应用套式PCR和细菌分离两种方法检测奶样中布鲁氏菌。结果显示，细菌分离的方法在奶样被103倍稀释时，即菌数为8×103CFU·mL-1能检测出阳性

图4 特异性试验Fig.4 Specificity test for the nested-PCR

2.5 与试管凝集试验符合性试验结果

应用套式PCR方法检测乳样中的布鲁氏菌，每份乳样所对应的牛血清用试管凝集试验检测，检测结果见表3。结果显示38份试管凝集试验为阳性的奶样，套氏PCR均为阳性，22份试管凝视试验确定为阴性的奶样中，套氏PCR检测出3份阳性结果，19份阴性结果。建立的套氏PCR与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%，阴性结果的符合率是86.36%。

表3 套式PCR和试管凝集试验检测布鲁氏菌符合性试验结果Table 3 Results of nested-PCR and tube agglutination test

3 讨论与小结

（1）研究在邱昌庆[6]发表的奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术的方法的基础上优化了提取DNA的步骤。应用CTAB/NaCl方法，将蛋白酶K和RNaseA的终浓度都调整为600 μg·mL-1，共同作用2小时，这样，一定程度的节省了成本，同时也节省了时间，提取DNA的效果好。

（2）对套式PCR条件进行了优化，建立套氏PCR方法，反应条件一定要优化，它直接影响方法的特异性和敏感性。目前多数人选择单因素变量法优化PCR条件，2007年，杨莲茹等[12]建立了检测布鲁氏菌病原的PCR方法，2015年，Mohsen Zamanian MSc 等[13]也用建立的PCR的方法对血液中的布鲁氏菌进行了检测。研究选择了多因素正交试验的方法，能够对影响PCR结果的因素进行综合的优化，并对结果进行直观的分析，优化后套式PCR的敏感性可达8 CFU·mL-1，这种优化方法的效率高，试验设计科学，结果稳定、可靠、敏感性好。

（3）细菌分离的方法仍然是确诊布鲁氏菌病的金标准，但是套式PCR试验的敏感性比细菌分离的敏感性好很多，因为前者的检测对象是细菌的染色体，受影响因素少，而细菌分离的结果受到存放条件、污染、操作人员技术和培养基等多因素影响，这些都会使细菌分离试验的检出率低。这与Stella Mitka[14]和Amin等[15]的结果一致。

（4）2007年，Stella Mitka等[14]对PCR的方法与血清凝集试验进行比较研究，证实了PCR方法有超高的敏感性和特异性。研究应用建立的套式PCR方法检测农场送检的奶样，并与奶样对应的血清样本的试管凝集试验进行比较。结果凝集试验血清阳性样本与对应的奶样的套式PCR检测阳性结果100%符合，而从试管凝集试验阴性结果的血清对应的奶样中PCR方法检测出布鲁氏菌的DNA片段，两者的符合度达86.36%，说明套式PCR方法敏感性高于试管凝集试验，这与Stella Mitka等的结果一致。此外，血清学方法中的ELISA方法也是具有高敏感性的一种检测方法，但由于该方法不能够将疫苗株与田间毒株感染产生的抗体区分开来，所以，很多时候将ELISA方法应用于对牛群的普查。

（5）研究建立的套式PCR方法快速、敏感、特异，能通过奶样检测布鲁氏菌，可以很方便用于布鲁氏菌病诊断。

［1］Mirnejad R M，Mohamadi M，Piranfar V，et al.A duplex PCR for rapid and simultaneous detection of Brucella spp. in human blood samples［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2013（6）：453-456.

［2］Anne Mayer-Scholl，Angelika Draeger，Cornelia Gollner，et al.Adwancement of a multiplex PCR for the differentiation of all currently described Brucella species［J］.Journal of Microbiological Methods，2010，80（1）：112-114.

［3］Fabrizio De Massis，Giuliano Garofolo，Cesare Camma，et al.Genetic characterization of Brucella melitensis and Brucella abortus geographical clusters in Italy［J］.Vet Ital，2015，51（3）：225-233.

［4］孙婷婷，金京顺，贾立军.新孢子虫与弓形虫交叉抗原基因AMA 1的克隆及原核表达载体构建［J］.延边大学农学学报，2015（1）：8-11.

［5］Fekete A，Bantle JA，Halling SM，et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction ［J］.Journal of Applied Bacteriology，1990，69（2）：216-227.

［6］邱昌庆，曹小安，杨春华，等.乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究［J］.中国兽医科技，2005，35（2）：85-89．

［7］杜振昆，郭军庆，张妙仙，等.牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法的建立［J］.浙江大学学报，2008，34（2）：169-174.

［8］C.Romero I，Lopez-Goni.Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of bucella spp.by PCR［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999（65）：3735-3737.

［9］Anne，Praud，Olivier，et al.Evaluation of five serological tests for the diagnosis of porcine brucellosis in French Polynesia［J］.Tropical Animal Health and Production，2013，45（4）：931-933.

［10］王嵩，林红丽，王宇鹏，等.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（3）：26-29.

［11］Betsy J，Bricker.PCR as a diagnostic tool for brucellosis ［J］.Veterinary Microbiology，2002（90）：435-446.

［12］杨莲茹，乌伦吉如嘎，王建明，等.奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法的建立［J］.内蒙古农业大学学报，2007，28（2）1-5.

［13］Mohsen Zamanian MSc，Gholam Reza Hashemi Tabar，Mehrnaz Rad，et al.Evaluation of Different Primers for Detection ofBrucella in Human and Animal Serum Samples by Using PCR Method［J］.Arch Iran Med，2015，18（1）：44-50.

［14］Stella M，Constantine A，Efimia S，et al.Evaluation of different PCR Assays for Early Detection of Acute and Relapsing Brucellosis in Human in Comparison with Conventional methods［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45（4）：1211-1218.

［15］Amin A S，Hamdy M E，Ibrahim A K.Detection of Brucella melitensis in semen using the polymerase chain reaction［J］.Vet Micribiol，2001，83（1）：37-44.

［16］曹小安，邱昌庆，周继章，等.Nested-PCR试剂盒检测牛精液中的布鲁氏菌DNA［J］.中国人畜共患病学报，2008，24（2）：137-139.

Establishing the Method to Test Bacterium Burgeri in Milk Using Nested Polymerase Chain Reaction Assay

Luan Yunyan，Lin Hongli，Hou Xilin
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to detect Bacterium burgeri in clinical milk samples，the nested PCR for Omp31 gene was established.The extraction method of the genomic DNA of Bacterium burgeri was improved and the nested PCR reaction sets were optimized by orthogonal test.The first optimized PCR reaction condition：annealing temperature 56.4℃，Mg2+concentration 1.5 mmol·L-1，the rTag DNA polymerase 0.2 μL，Primer 0.3 uM，dNTP concentration 0.2 mM.The second PCR optimization condition：annealing temperature 53.3℃，Mg2+concentration 1.5 mmol·L-1，the DNA polymerase 0.25 μL，Primer 0.4 uM and dNTP concentration 0.1 mM.The sensitivity of nested PCR was 8 CFU·mL-1which was 1 000 times higher than bacterial isolate method.The specificity test showed that there was no cross reaction with Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Yeast，Bacillus and Klebsiella.Compared with test tube agglutination，the positive coincidence rate was 100%and the negative coincidence rate was 86.36%.This nested PCR assay could be applied to detect the Bacterium burgeri in milk.

Bacterium burgeri；nested PCR；milk sample；dairy cow

S852.61

A

1002-2090（2016）05-0042-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.008

2015-12-08

国家科技计划课题（2012BAD12B05-2）。

栾云艳（1988-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2013级硕士研究生。

侯喜林，男，教授，博士研究生导师，E-mail：xly-hou@163.com。