NF-κB信号通路与肿瘤放、化疗抵抗研究进展

许瑞雪 吕洪涛 许友松 刘荣耀

(大连医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 大连 116011)

·综述·

NF-κB信号通路与肿瘤放、化疗抵抗研究进展

许瑞雪*吕洪涛 许友松 刘荣耀

(大连医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 大连 116011)

核转录因子κB; DNA损伤; 放化疗抵抗; 肿瘤

早在1986年，Sen及Baltimore就发现了核转录因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)及其抑制因子IκBα[1]。因其是从B淋巴细胞提取物中检测到的一种可与免疫球蛋白的κappa链基因增强子序列特异结合的核因子，故命名为细胞核因子或κ基因结合核因子。至今，NF-κB信号通路在炎症反应、免疫应答及肿瘤发生发展中的功能及作用机制仍是研究热点。基于NF-κB调控基因的多样性，近年来人们发现NF-κB通路是一把双刃剑，具有双向效应。当外来病原菌感染宿主时，NF-κB通路会被激活并介导干扰素-γ等抗病毒因子的表达，抑制病毒复制。但过度激活的NF-κB会导致大量炎性因子表达，给机体带来免疫损伤[2]。NF-κB促进细胞凋亡能抑制肿瘤发生，而异常活化的NF-κB则能推进细胞周期演进并抑制凋亡，从而促进细胞癌变[3]。目前已发现许多种肿瘤性疾病，包括伯基特淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管癌及宫颈癌等都与NF-κB的持续性激活有关[4]。因此，NF-κB信号通路需要精确调控，激活的NF-κB需要适时负调控才能使其在正常水平发挥生理功能。

近年来，有临床证据表明NF-κB活性增高与术后肿瘤细胞对放、化疗不敏感有关[5]。2000年，Huang等[6]证明用喜树碱(camptothecin, CPT)处理细胞造成的DNA损伤能特异性激活NF-κB信号通路。首次发现了细胞核内的信号可以通过特定分子传导至细胞质中，从而调控细胞质中NF-κB信号通路的传导。该研究拓宽了人们对NF-κB通路的认识，并解释了为什么放化疗造成的DNA损伤激活的NF-κB活性持续增高会导致放化疗耐受。肿瘤细胞的抗凋亡作用被认为是放化疗耐受的主要原因，而NF-κB具有抗凋亡及促凋亡双方面的效应。低水平的DNA损伤时，NF-κB抑制细胞凋亡，促进DNA修复；而高水平DNA损伤时，NF-κB则促进细胞凋亡。细胞通过精细调控NF-κB来确保正常生命活动。一旦NF-κB活性异常增高或者持续活化，则表现出抗凋亡作用，并通过诱导包括环氧酶2(cycio-oxygen-ase 2, COX 2)，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)，B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2)家族，Survivin及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)等靶基因的表达，导致肿瘤细胞对化疗或放疗产生抗性[7]。由于NF-κB介导的下游靶基因有很大一部分是细胞正常生命进程所需要的，因此广谱阻断NF-κB意味着很多不良反应的产生。因此，深入探讨特定条件下诱导激活的NF-κB通路，有利于我们对NF-κB通路对促进肿瘤放化疗抗性作用的认识，从而提出特异而有效的个体化治疗方案。下面对DNA损伤诱导的NF-κB通路及其与肿瘤放化疗抵抗的关系做一综述。

一、经典NF-κB通路

经典NF-κB信号通路的传导是发生在细胞质中的级联反应。当细胞受到外界刺激，比如用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)处理细胞时，细胞表面的TNFα受体与之结合，并迅速募集一系列蛋白复合物，例如接头蛋白肿瘤坏死因子受体相关死亡蛋白(TNF receptor-associated death domain, TRADD)，受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1, RIP1)，泛素连接酶E3，包括肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2, TRAF2)，肿瘤坏死因子受体相关因子5(TNF receptor-associated factor 5, TRAF5)，凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1, cIAP1)，凋亡抑制蛋白2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2, cIAP2)和泛素连接酶复合物(the linear ubiquitin assembly complex, LUBAC)，以及去泛素化酶A20，肿瘤抑制因子(cylindromatosis, CYLD)等等。在该蛋白复合体中，RIP1被几个或所有的E3催化形成K63型多聚泛素链。RIP1形成的K63型泛素链是募集并激活下游转化生长因子激酶1(TGF-activated kinase 1, TAK1)及核转录因子-κB激酶(IκB kinase, IKK)复合体的关键步骤。TAK1复合体中的TAB2及IKK复合体中的核转录因子-κB激酶γ(IκB kinase γ, IKKγ)含有泛素结合结构域，可与泛素链结合。TAK1通过TAB2结合的K63型泛素链发生自身磷酸化并激活核转录因子-κB激酶β(IκB kinase β, IKKβ)。另外，核转录因子-κB激酶α/β(IκB kinase α/β, IKKα/β)通过与核转录因子κB重要调控因子(NF-kappa-B essential modulator, NEMO)结合，稳定IKK与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1)复合体的相互作用，随后RIP1通过有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3, MEKK3)激活IKK。活化的IKKβ磷酸化IκBα并促使其发生K48型泛素化修饰及降解。被IκBα屏蔽的NF-κB得以释放，并迅速进入细胞核，行使转录因子的功能，介导靶基因表达[4]。NF-κB调控的基因种类多样，包括免疫和炎症相关的细胞因子，细胞增殖和凋亡相关基因，细胞粘附因子等。因此，NF-κB与多种正常或疾病状态(如免疫、炎症、肿瘤等)相关。不同的细胞外刺激，募集的蛋白激酶及泛素链接酶E3不同，但位于K63型泛素链下游的信号传导都由TAK1/TAB2及IKK复合体来完成。活化的NF-κB信号通路需要控制在生理水平，因此细胞也配备了相应的负调控机制。去泛素化酶肿瘤抑制因子圆柱瘤基因(Cylindromatosis, CYLD)及锌指蛋白A20就扮演着负调控作用。A20一方面可介导TNF刺激下的RIP1的K63型去泛素化，同时还介导RIP1上K48型泛素化降解，从而抑制NF-κB的持续激活[8]。

二、DNA损伤应答及DNA损伤激活的NF-κB通路

1.DNA损伤应答通路：不同的DNA损伤剂能够诱导不同的DNA损伤，例如电离辐射能直接诱导产生DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)，而甲基化剂和顺铂则能诱导复制阻滞，最终导致DSBs形成。细胞发生DNA损伤后，损伤识别因子便对损伤进行识别，依据损伤类型及损伤程度不同，启动不同的信号传导通路，激活细胞周期监测点，延迟细胞周期进行，激活DNA修复功能。当DNA损伤不能被修复，或者DNA损伤过多时，细胞周期监测点会启动细胞周期永久停滞机制或者启动细胞凋亡机制来清除具有潜在危险的细胞。这一系列的级联反应是由DNA损伤感受器，主要是毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ataxia-telangiectasis mutated, ATM)和ATM和Rad3相关蛋白 (ATM-Rad3-related, ATR)来识别并传导的。ATM对双链DNA损伤做出反应，属于磷脂酰肌醇3激酶样蛋白激酶[9]；ATR对DNA大的损伤或复制叉受阻的损伤做出反应[10]。DSBs导致染色质结构改变，产生信号诱导ATM发生自身磷酸化。ATM自身磷酸化后，一方面能够介导组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)，γ-H2AX将DNA损伤和重组蛋白如乳腺癌易感基因1、P53结合蛋白1、DNA损伤关卡蛋白1、DNA修复蛋白等募集到DNA损伤处，启动损伤修复；另一方面，磷酸化的ATM介导p53，检验点激酶2(Checkpoint kinase 2, Chk2)等周期监测点蛋白磷酸化[11]，促进G1/S、S、G2/M周期阻滞，为DNA损伤修复提供时间。当DNA修复失败时，细胞将启动凋亡程序。p53和NF-κB通路是DNA损伤诱导凋亡的主要途径[12]。p53和NF-κB通路在DNA损伤相关的凋亡反应中起双重作用，低水平的DNA损伤时，抑制细胞凋亡，促进DNA修复；高水平DNA损伤时，促进细胞凋亡。不同的反应机制可能依赖于DNA损伤的程度及细胞耐受能力[13]。

2.DNA损伤激活的NF-κB通路：Huang等[6]证明用喜树碱处理细胞造成的DNA双链损伤(DSBs)能特异性激活NF-κB信号通路。当时困扰研究者的一个主要问题是细胞核内的信号如何激活细胞核外的NF-κB通路传导。近年来研究者发表了系列文章阐述了ATM及细胞核内NEMO的翻译后修饰,如小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)化、磷酸化及泛素化，共同行使从核内到核外传递信号的功能。依据DNA损伤程度不同及细胞反应性不同，目前提出了以下几种作用模式：①ELKS介导模式：DNA损伤后，NEMO从细胞质转移到细胞核并被SUMO化修饰，然后核内的ATM与之结合并使之磷酸化，磷酸化的NEMO与ATM以复合体的形式出核，并募集泛素连接酶(E3)X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)，泛素结合酶(E2)Ubc13及一个富含赖氨酸的蛋白ELKS。在该复合物中，XIAP催化ELKS发生K63型多聚泛素化修饰，从而激活TAK1/TAB2、IKK复合体，以与经典NF-κB通路相同的方式激活下游信号传导[14]。②RIP1介导模式：基因组损伤后，RIP1 被SUMO化修饰并出核，与NEMO、ATM、及TAK1形成复合体，在该复合体中RIP1被催化形成K63型泛素链，从而募集并激活TAK1/TAB2、IKK复合体，激活下游信号传导[15]。③TRAF6模式：基因组损伤激活PARP-1及ATM，并募集NEMO及PIASy。形成的复合体介导NEMO的SUMO化修饰及ATM的磷酸化修饰。ATM以钙离子依赖的方式转移至细胞质及细胞膜，并激活TRAF6发生自身泛素化形成K63型多聚泛素链，SUMO化修饰的NEMO以单体的形式出核，与IKK复合体汇合，从而激活TAK1/TAB2及IKK复合体，启动下游信号传导。三种模式通过不同的中间蛋白形成K63型泛素链，启动相同的TAK1/TAB2→IKK→IκBα信号传导[16]。如前所说，激活的NF-κB需要适时负调控。目前关于DNA损伤诱导的NF-κB信号通路的负调控机制还知之甚少。有研究表明，SUMO特异性蛋白酶(SUMO specific protease, SENP2)可以促进SUMO化修饰的NEMO去SUMO化修饰，从而抑制损伤信号的传导[17]。更多的负调控机制还有待深入研究。

三、NF-κB通路与肿瘤放化疗抵抗

无论是化学药物还是放射治疗，都能通过损伤DNA，阻断细胞增殖以达到消除肿瘤的目的，DNA损伤将特异性激活NF-κB。研究还发现在一些耐药细胞系，如多重耐药肿瘤细胞FM3A/M中，NF-κB的表达和基础水平比其亲体细胞明显增强，而NF-κB的抑制因子IκB的表达则明显下降。一些耐药基因的启动子中还含有NF-κB的结合序列，从而增强耐药基因的表达。研究表明NF-κB主要通过三方面机制导致肿瘤抗性：刺激细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞侵袭与转移。具体机制如下[18]：①上调CyclinD1的表达，促进细胞周期由G1/G0期向S期转化，引发细胞的无限增殖；或激活靶基因如白细胞介素(interleukin 2, IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等的表达，产生生长因子，刺激细胞增殖。②通过抑制细胞死亡信号的转导，保护细胞免受TNF和其他刺激因素诱导的细胞凋亡。③促进血管内皮生长因子(vescular endothelial growth factor, VEGF)，细胞间粘附因子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)和尿激酶等生长因子，粘附分子和酶类等与肿瘤侵袭及转移相关分子的表达。

目前研究得比较多的是NF-κB与化疗耐受性的关系。Uetsuka等使用5-氟尿嘧啶作用人胃癌NUGC3细胞株后，NF-κB活化，增强了NUGC3细胞株对5-氟尿嘧啶的耐受性。但是，加入NF-κB阻断剂后，NUGC3细胞株对5-氟尿嘧啶所致的促细胞凋亡作用明显增高[19]。Patel等[20]发现NF-κB在乳腺癌细胞中呈现持续活化，使抗凋亡基因c-AIP2过度表达，使得乳腺癌细胞耐药性增加。Bentires-Alj等[21]报道NF-κB通过上调多重耐药基因的表达而增加结肠癌细胞株HCT15对化疗药物道诺霉素的耐受性。相反，阻断NF-κB的活化，能使多重耐药基因的mRNA和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达减少而增加对道诺霉素的敏感性。许瑞雪等[22]研究发现，电离辐射可激活人胶质母细胞瘤T98G细胞(T98G细胞)NF-κB通路，抑制NF-κB可增强T98G细胞对电离辐射对敏感性。提示NF-κB通路在胶质瘤放疗抵抗中可能发挥重要作用。

在抑制NF-κB活化的药物中，硼替佐米(bortezomib，商品名：万珂velcade)是目前全球唯一被批准的抗肿瘤临床治疗的蛋白酶抑制剂。硼替佐米属于可逆性蛋白酶体抑制剂，可以选择性地与蛋白酶体活性位点的苏氨酸结合，抑制蛋白酶体20S亚单位的糜蛋白酶和胰蛋白酶活性，可通过抑制IκB的降解，阻止NF-κB的活化，诱导骨髓瘤细胞凋亡[23]。

综上所述，NF-κB的活化与肿瘤发生、发展、转移及放化疗抗性有关，抑制NF-κB的活化能减缓肿瘤的生长及转移，并增强放化疗敏感性。理想的NF-κB抑制剂应是只特异性地作用于肿瘤细胞，而非正常细胞，并且能避免机体免疫功能异常的发生。所以，针对DNA损伤诱导的NF-κB通路研究具有重要的临床意义。例如，Xu等[24]研究表明miR181b可以靶向于SUMO特异性蛋白酶(SUMO specific protease, SENP2)，从而使DNA损伤诱导的NF-κB通路持续激活，造成放疗抵抗。因此针对特异性DNA损伤激活的NF-κB信号通路的调控将来有望对肿瘤治疗具有更高的特异性和更广阔的临床应用前景。

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1671-2897(2017)16-475-03

辽宁省博士启动基金资助项目(201601235)

许瑞雪，主任医师，E-mail:xrx1976@163.com

*通讯作者：许瑞雪，主任医师，E-mail:xrx1976@163.com

R 739

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2015-07-08；

2017-06-05)