肾虚血瘀证树鼩动物模型构建初探

郭尔楚 黄金兰 陈 奔 郭茜茜 冯晓桃 钟振国

(1 广西中医药大学新药研究开发中心，南宁，530001； 2 徐州医科大学药学院，徐州，221004； 3 广西中医药大学广西中医药科学实验中心，南宁，530001)



肾虚血瘀证树鼩动物模型构建初探

郭尔楚1黄金兰2陈 奔1郭茜茜1冯晓桃3钟振国1

(1 广西中医药大学新药研究开发中心，南宁，530001； 2 徐州医科大学药学院，徐州，221004； 3 广西中医药大学广西中医药科学实验中心，南宁，530001)

目的：探索肾虚血瘀证树鼩动物模型的制做方法。方法：将树鼩随机分为对照组、模型1组(腹腔注射氢化可的松结合肾上腺素)和模型2组(腹腔注射氢化可的松结合角叉菜胶)，5只/组，通过观察树鼩表征、脏器指数、血液流变学、下丘脑-垂体-靶腺轴(甲状腺轴、性腺轴)激素水平的变化情况评判肾虚血瘀证模型是否建立。结果：造模后动物均出现“耗竭”现象，肾、前列腺、脾、睾丸不同程度肿大，模型2组甲状腺萎缩；模型1组血清中雌二醇(E2)和睾酮(T)水平及模型2组中甲状腺激素(FT3、FT4)、E2水平显著下降；血液流变学结果显示模型2组血液黏度和红细胞压积增高，而模型1组无显著变化。结论：腹腔注射氢化可的松与肾上腺素的方法能够较好地模拟肾虚血瘀证树鼩动物模型。

肾虚血瘀；树鼩；动物模型

树鼩(学名：Tupaia belangeri，tree shrew)，树鼩科树鼩属的动物，分布在东南亚各国。树鼩是一种新型实验动物，由于其解剖特征近似于人类，已成功建立了多种人类疾病的动物模型，并在病毒学、神经生物学、生殖生物学和社会心理学等方面有相当广泛的应用和研究[1-2]。肾虚血瘀是目前中医较为常见的证候，肾虚导致血瘀，血瘀所致肾虚，即肾虚与血瘀并见。研究发现，肾虚血瘀与糖尿病[3]、冠心病[4]、高血压[5]、慢性炎性反应[6]等的发病有明显关系，是各种慢性疾病某一特定阶段的共同病理变化和致病原因。目前，对于肾虚血瘀证动物模型的较多是由多个中医证候或病证结合引起的研究。因此，建立稳定、重复性强的肾虚血瘀证动物模型，能够为相关疾病治疗药物的研发提供强有力载体。研究表明，树鼩因其许多分子与细胞结构近似人类，具有与人相似的脑神经和视觉神经，目前已成功用于多种人类病毒感染的动物模型的建立，而利用树鼩构建肾虚血瘀证动物模型尚未有探索，我们以树鼩为研究对象，初步探索建立肾虚血瘀证动物模型的方法，为各种慢性疾病的科研研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10～12个月龄中缅树鼩滇西亚种，雄性，体重120～140 g，由昆明医科大学实验动物学部提供(动物许可证号：SCXK(滇)K2013-0002)。1.2 主要试剂与仪器 盐酸肾上腺素注射液(远大医药(中国)有限公司，批号：131204)；氢化可的松注射液(河南润弘制药股份有限公司，批号：1312071)；角叉菜胶(Sigma公司，批号：CAS9000-07-1)；水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂，批号：20130513)。化学发光仪(UniCel DxI，型号800)；血流变快测仪(重庆维多科技有限公司，FASCO系列-2050A)。

1.3 分组与造模 将树鼩随机分对照组、肾虚血瘀证树鼩动物模型1组(以下简称模型1组)和肾虚血瘀证树鼩动物模型2组(以下简称模型2组)，5只/组。模型1、2组在第1～3天每天腹腔注射氢化可的松(1 mg/100 g)；第4～5天继续腹腔注射氢化可的松(1.5 mg/100 g)；第6～8天，模型1组每天腹腔注射肾上腺素(1 mg/100 g)，模型2组每天腹腔注射角叉菜胶(7.5 mg/100 g)，对照组每天注射等量的生理盐水。

1.4 观察指标

1.4.1 树鼩表征变化 包括树鼩行为、体征观察及体重变化。

1.4.2 树鼩血液流变学变化 第7天，腹主动脉抽血，血液流变仪检测各组动物全血黏度、还原黏度、血浆黏度、红细胞压积、卡松黏度、卡松屈服应力以及纤维蛋白原的变化。

1.4.3 树鼩下丘脑-垂体-靶腺轴(甲状腺轴、性腺轴)变化 血液流变学检测后，将血液以3 000 r/min速度离心5 min，取上清液，化学发光法测定检测各组动物血液三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、雌二醇(E2)、睾酮(T)的含量。

1.4.4 树鼩脏器指数比较 动物称重、取血后，称取各组动物肾、前列腺、脾、甲状腺、睾丸重量，按公式[脏器指数=脏器湿重(g)/树鼩体重(100 g)]计算其相关指数。

2 结果

2.1 树鼩行为、表征观察及体重变化 对照组树鼩反应灵敏、喜动、动作灵活、皮毛光泽，大便正常。模型1组和模型2组树鼩均出现明显的精神萎靡、倦怠、身体蜷缩、竖毛、少动、喜卧、皮毛蓬乱无光泽，大便干结症状。体重增加，模型1组树鼩体重变化明显高于对照组[(123.25±4.99)g，(109.60±6.58)g，P=0.024]，模型2组树鼩体重变化与对照组相似[(111.20±10.20)g，(109.60±6.58)g，P=0.751]。

2.2 血液流变学变化

2.2.1 不同切变率状态下血液黏度的比较 与对照组比较，模型1组和模型2组树鼩还原黏度和全血黏度在不同切变率状态下均有不同程度升高，其中模型1组树鼩还原高切(100/s)黏度和全血黏度(100/s、40/s、10/s)显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2.2 血浆黏度、红细胞压积、卡松黏度、卡松屈服应力级纤维蛋白原的比较 由表2可知，与对照组比较，模型1组和模型2组的血浆黏度、红细胞压积、卡松黏度、卡松屈服应力及纤维蛋白原均有不同程度升高，其中模型1组的各项指标差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同切变率状态下还原黏度、全血黏度比较

注:与对照组比较*P<0.05。

表2 各组血浆黏度、红细胞压积、还原黏度、卡松黏度、卡松屈服应力及纤维蛋白原的比较

注:与对照组比较*P<0.05。

表3 各组树鼩脏器指数的比较

注:与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

2.2.3 脏器指数比较 与对照组比较，模型1组和模型2组的肾指数、脾指数、前列腺指数和睾丸指数数值均升高，其中模型2组的肾指数、模型1组与模型2组的前列腺指数差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，而模型1组和模型2组的甲状腺指数数值偏低，数模型2组降低显著(P<0.05)。

2.2.4 血清中FT3、FT4、E2、T的比较 与对照组比较，模型1组的FT3、E2和T及模型2组的FT3、FT4、E2均有所下降，其中模型1组的E2、T水平，模型2组中的FT3、FT4、E2的变化差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组树鼩血清中FT3、FT4、E2、T的变化

注:与对照组比较*P<0.05。

3 讨论

肾上腺皮质激素法是最早用于制造肾虚动物模型的方法[7]，通过大剂量外源性皮质激素早期能使机体呈烦躁等肾阴虚表现，但由于肾上腺皮质激素可使促肾上腺皮质激素释放受抑制，而使类固醇激素分泌减少，所以出现一系列如体温下降、活动减少、反应迟钝、弓背蜷缩、畏寒、体毛稀疏无光泽等一系列“耗竭”现象，即出现“阴损及阳”的转变。根据《中医虚证辨证参考标准》[8]中对虚证动物模型的诊断标准，我们观察到模型1组和模型2组树鼩精神萎靡、倦怠、身体蜷缩、竖毛、少动、喜卧、皮毛蓬乱无光泽，大便干结症状及体重增加症状，因此，本实验由氢化可的松诱导的肾虚证模型是符合要求的。

中医认为肾为先天之本，肾虚与下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺轴、甲状腺轴、性腺轴)的紊乱[9]、免疫功能下降有关。药物干预后，我们比较了对照组、模型组树鼩肾脏、脾、甲状腺、前列腺和睾丸的重量，发现与对照组比较，模型1组和模型2组的肾指数、脾指数、前列腺指数和睾丸指数数值均有不同程度的升高，说明模型动物的肾脏、脾、甲状腺、前列腺和睾丸均有不同程度的肿大，而模型1组和模型2组的甲状腺指数数值偏低，数模型2组降低显著(P<0.05)，提示模型2组的甲状腺有一定的萎缩现象。针对激素水平的变化，我们主要对下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴进行相关生化指标的测定。数据显示，与对照组比较，模型1组的FT3水平有下降趋势，模型2组FT3和FT4的变化下降明显(P<0.05)。模型1组雌二醇和睾酮水平均明显下降(P<0.05)，模型2组中的雌二醇水平均明显下降(P<0.05)，但睾酮水平差异无统计学意义。因此，从甲状腺功能和生殖系统功能指标上评判，模型1组和模型2组在一定程度上均符合肾虚模型的要求。

李积敏在《肾虚血瘀论》认为久病则虚，虚则气血运行不畅，气血运行不畅则易产生瘀滞。瘀滞形成，则阻碍机体气血生新不顺，则机体虚弱更甚。可见肾虚与血瘀是相辅相成的。本研究过量使用氢化可的松制成肾阳虚模型的基础上分别加用肾上腺素[10]和角叉菜胶[11]建立血瘀模型，血液流变学考证血瘀模型的建立与否。在血液流变学检测中，全血黏度是反映血液流变学特性的直观指标，而影响全血黏度的因素有红细胞压积、血浆黏度、红细胞聚集性、红细胞变形性、血小板的凝聚性和黏附性等。实验结果显示，除了中、低切还原黏度外，模型1组树鼩的血液流变学指标与对照组比较，均明显升高(P<0.05)，提示模型1组树鼩的血液黏度和红细胞压积增高，变形性降低等血流缓慢、循环障碍特点，血液呈现浓、黏、聚、凝的状态，符合中医血瘀证血液流变学之共性，而模型2组各项血液流变学指标与对照组比较均无差异。由此可知，模型1组造模方法能较好初步建立血瘀证树鼩模型。

综上实验结果，模型1组表现出良好的肾虚和血瘀征象，证实腹腔注射氢化可的松结合皮下注射肾上腺素的方法可较好地模拟肾虚血瘀证树鼩动物模型。

[1]彭燕章，叶智彰，邹如金，等.树鼩生物学[M].昆明:云南科技出版，1991:1-4.

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(2016-10-17收稿 责任编辑：洪志强)

Study on Tree Shrews Model of Kidney Deficiency and Blood Stasis

Guo Erchu1, Huang Jinlan2, Chen Ben1, Guo Xixi1, Feng Xiaotiao3, Zhong Zhenguo1

(1CenterofResearch&DevelopmentofNewDrugs,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China; 2DepartmentofPharmacology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China; 3Scienceexperimentcenter,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China)

Objective:To explore the way to establish the kidney and blood stasis model in tree shrew. Methods: Tree shrews were randomly divided into 3 groups: normal group, model group 1 (injection of Hydrocortisone and Adrenaline) and model group 2 (injection of Hydrocortisone and Carrageenan). The kidney deficiency and blood stasis model was evaluated by observation of representation of tree shrews, detecting visceral index, hemorheology parameters and the level of hypothalamus-pituitary-target gland axis (thyroid axis, gonad axis). Results: The animal been treated all appeared “exhausted” phenomenon, the kidney, prostate, spleen, testis of the model groups were swelling, but the thyroid in model group 2 was atrophied. The levels of E2 and T in model group 1, levels of FT3、FT4 and E2 in model group 2 declined remarkably. The results of hemorheology showed that the blood viscosity and hematocrit increased in model group 1. Conclusion: The tree shrews model of kidney deficiency and blood stagnation can be established by injection of hydrocortisone and adrenaline.

Kidney deficiency and blood stasis; Tree shrew; Model

广西科学研究与技术开发计划项目(编号：桂科攻1347003-1)

郭尔楚，男，助教，硕士学位，研究方向：新药研究与开发，E-mail：1050457662@qq.com

钟振国，男，医学博士，研究方向：新药研究与开发，单位：广西中医药大学新药研究开发中心，地址：广西南宁市明秀东路179号广西中医药大学，邮编：530001，E-mail：gxtcmuzzg@163.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.003