丁酸钠对HEK293细胞中DDAH2表达的作用

李英慧, 孙 陆, 陈凯师

(中国医科大学 基础医学院, 辽宁 沈阳 110122)



丁酸钠对HEK293细胞中DDAH2表达的作用

李英慧, 孙 陆, 陈凯师

(中国医科大学 基础医学院, 辽宁 沈阳 110122)

以一种去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaBu)作为乙酰化刺激因素,探讨乙酰化在DDAH2表达中的作用.以NaBu刺激人胚肾293(HEK293)细胞,应用real-time PCR和Western印迹杂交方法检测DDAH2 mRNA和蛋白表达水平.结果显示NaBu以时间和浓度依赖方式上调DDAH2 mRNA表达水平,同时对DDAH2蛋白表达水平亦起到明显的上调作用.

丁酸钠; 乙酰化; DDAH2

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种重要的生物活性小分子,具有舒张血管、调节血管内皮功能等功能,因此在人体血压调节等方面具有重要作用.在体内NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化合成,包括神经型NOS(neuronal NOS, nNOS)、诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)和内皮型NOS (endotheliao NOS, eNOS).而非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是体内三种NOS的抑制剂,可抑制NOS作用,因此可显著抑制内源性NO生物合成.二甲基精氨酸二甲胺水解酶2(DDAH2)可水解体内ADMA[1],因此在调节体内NO合成水平中至关重要.乙酰化是一种重要的表观遗传学修饰,组蛋白和转录因子的乙酰化已被证实参与多种基因的表达调控[2].丁酸钠(sodium butyrate, NaBu)是一种去乙酰化酶抑制剂,可促进多种蛋白质的乙酰化[3].因此,本研究以NaBu作为乙酰化作用因素,探讨其对HEK293细胞中DDAH2表达水平的影响.

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HEK293细胞培养于质量分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中.培养条件37 ℃,CO2体积分数为5%,饱和湿度.应用不同浓度和不同刺激时间的NaBu作用细胞,刮取法收获细胞.

1.2 RNA提取、反转录及real-time PCR

收获细胞,常规方法应用TRIzol试剂提取刺激或未刺激的HEK293细胞的总RNA,检测RNA浓度和纯度.应用TaKaRa公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板,SYBR Green方法在优化条件下进行real-time PCR扩增.扩增引物序列如下,DDAH2:5′-CCTCTTTCTTCGTCCTGGGT-3′(上游)和5′-CACAGGTACCAGGGTGACAT-3′(下游);β-actin:5′-CCGTCTTCCCCTCCATCG-3′(上游)和5′-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3′(下游).以β-actin为内参,检测DDAH2 mRNA相对表达量,每个样品重复5次,取平均值.

1.3 细胞总蛋白提取和Western印迹杂交

应用RIPA试剂提取NaBu刺激和未刺激的HEK293细胞的总蛋白,测定蛋白浓度.将蛋白上样于质量分数为8%～10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳.凝胶4 ℃下转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜.应用含有体积分数为0.1% Tween-20和质量分数为5%脱脂奶粉的TBS缓冲液室温封闭1 h.1∶1 000稀释的DDAH2抗体(Santa Cruz公司)和1∶5 000稀释的β-actin(Cell Signaling公司)抗体室温杂交2 h,然后应用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交2 h.应用ECL发光试剂盒(Bio-Rad)进行检测.

2 结 果

2.1 NaBu对HEK293细胞中DDAH2 mRNA表达水平的影响

分别应用不同浓度的NaBu刺激HEK293细胞12 h,real-time PCR结果显示,当不同浓度NaBu刺激细胞时,DDAH2 mRNA表达水平随着浓度的增高而增加,1 mmol/L时显著升高,达到对照的1.9倍(图1a);接下来应用1 mmol/L NaBu刺激细胞4、8、12、24、48 h.24 h升高最为明显,达到对照的2.3倍(图1b).因此,后面采用1 mmol/L NaBu作用24 h作为刺激条件.

图1 NaBu对HEK293细胞中DDAH2 mRNA表达水平的影响

2.2 NaBu对HEK293细胞中DDAH2蛋白表达水平的作用

应用1 mmol/L NaBu刺激HEK293细胞24 h,提取总蛋白,应用Western印迹杂交方法检测DDAH2蛋白表达水平,结果显示与未刺激细胞相比,表达水平达到了对照的2.1倍(图2),其变化趋势与DDAH2 mRNA表达水平一致.这些结果提示NaBu介导的乙酰化可以显著上调DDAH2 mRNA和蛋白表达水平.

图2 NaBu刺激后DDAH2蛋白表达水平

3 讨 论

蛋白质的乙酰化是一种重要的表观遗传学修饰,组蛋白和多种转录相关因子的乙酰化在基因表达调控中具有重要作用.蛋白质的乙酰化水平受两种酶的调节,一种是乙酰转移酶(acetyltransferase),另一种是去乙酰化酶(deacetylase),两者的平衡使蛋白质维持正常的乙酰化水平[4].作者之前曾报道了乙酰转移酶p300能够上调DDAH2基因表达[5],本研究试图探讨抑制去乙酰化酶是否亦能够影响DDAH2表达水平.NaBu可以抑制去乙酰化酶的作用,而提高组蛋白及其他多种蛋白的乙酰化水平,从而能够在抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞衰老和凋亡等过程中发挥一定作用[6].

因此,本研究中使用NaBu作为乙酰化诱导剂,处理HEK293细胞,从而检测乙酰化在DDAH2基因表达中的作用.首先根据文献报道,本研究选取了0、0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L的浓度刺激细胞12 h后,应用real-time PCR方法检测DDAH2 mRNA表达水平,结果显示NaBu以浓度依赖方式上调DDAH2表达,但2.0 mmol/L的浓度使细胞死亡明显增加,因此在后续实验中选择1.0 mmol/L作为刺激浓度.接下来应用1.0 mmol/L NaBu分别刺激细胞0、4、8、12、24、48 h,结果显示24 hDDAH2 mRNA水平上升最为明显,48 h开始下降,推测这有可能是细胞内某些负反馈抑制作用的结果.接下来,进一步检测了DDAH2蛋白表达水平,结果显示1 mmol/L NaBu刺激24 h后,DDAH2蛋白水平显著上升,其变化趋势与mRNA水平一致.

综上,本研究显示NaBu诱导的乙酰化可以浓度和时间依赖方式上调DDAH2 mRNA和蛋白表达水平,这提供了参与DDAH2基因表达调控的一种分子机制.

[1] XUAN C,XU L Q,TIAN Q W,et al. Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (DDAH 2) gene polymorphism, asymmetric dimethylarginine (ADMA) concentrations, and risk of coronary artery disease: a case-control study[J]. Science Report, 2016,6:33934.

[2] ESKELAND R,FREYER E,LEEB M,et al. Histone acetylation and the maintenance of chromatin compaction by polycomb repressive complexes[J]. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2010,75:71-78.

[3] CHEN Y,DU J,ZHAO Y T,et al. Histone deacetylase (HDAC) inhibition improves myocardial function and prevents cardiac remodeling in diabetic mice[J]. Cardiovascular Diabetology, 2015,14(1):1-13.

[4] FILGUEIRAS L R,BRANDT S L,RAMALHO T R,et al. Imbalance between HDAC and HAT activities drives aberrant STAT1/MyD88 expression in macrophages from type 1 diabetic mice[J]. Journal of Diabetes & Its Complications, 2016,30:30341-30345.

[5] 李英慧,李家亓,孙陆. 人胚肾293细胞中乙酰转移酶p300对二甲基精氨酸二甲胺水解酶2基因表达的调节[J]. 中国循环杂志, 2013,28(1):59-62. (LI Y H,LI J Q,SUN L,et al. Regulation of dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 gene expression by acetyltransferase p300 in human embryonic kidney 293 cell[J]. Chinese Circulation Journal, 2013,28(1):59-62.)

[6] DAMIANI R,ALMEIDA B E,OLIVEIRA J E,et al. Enhancement of human thyrotropin synthesis by sodium butyrate addition to serum-free CHO cell culture[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2013,171(7):1658-1672.

【责任编辑: 李 艳】

Effect of Sodium Butyrate on DDAH2 Expression in HEK293 Cells

LiYinghui,SunLu,ChenKaishi

(College of Basic Medical Science, China Medical University, Shenyang 110122, China)

An inhibitor of acetyltransferses, sodium butyrate (NaBu) was used to treat human embryonic kidney (HEK) 293 cells, and real-time PCR and Western blot were used to analyze the expression ofDDAH2 mRNA and protein. The results demonstrate that NaBu can up-regulate the expressionDDAH2 mRNA in a concentration and time dependent manner. Also it can evidently increase the DDAH2 protein level.

sodium butyrate; acetylation; DDAH2

2016-10-21

国家自然科学基金资助项目(30900807); 辽宁省自然科学基金资助项目(2014021061).

李英慧(1976-),女,辽宁沈阳人,中国医科大学教授,博士.

2095-5456(2016)06-0443-03

R 394.3

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