定量检测SLIT2基因甲基化对高级别宫颈癌前病变的诊断价值

袁立芹，胡元晶

定量检测SLIT2基因甲基化对高级别宫颈癌前病变的诊断价值

袁立芹1，胡元晶2△

目的 探讨神经导向因子2（SLIT2）基因甲基化定量检测对于高级别宫颈癌前病变的临床诊断价值。方法收集178例高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染患者的宫颈脱落细胞，以组织病理学诊断作为金标准，分为正常宫颈组（n=45）、低级别病变组（n=50）和高级别病变组（n=83）。采用焦磷酸测序法定量检测各样本中SLIT2基因的甲基化水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线确定SLIT2基因的甲基化水平对高级别宫颈癌前病变的诊断阈值。结果正常宫颈组SLIT2基因的甲基化水平为（4.53±1.37）%，低级别病变组为（5.81±2.26）%，高级别病变组为（11.80± 8.47）%，组间差异有统计学意义（F=27.61，P＜0.001）；高级别病变组高于正常宫颈组和低级别病变组（均P＜0.001），正常宫颈组和低级别病变组之间差异无统计学意义（P=0.297）。SLIT2基因甲基化定量检测诊断高级别宫颈癌前病变的灵敏度为80.7%，特异度为83.2%，最佳界值为6.41%。结论采用焦磷酸测序法定量检测宫颈脱落细胞中SLIT2基因甲基化水平能够有效诊断高级别宫颈癌前病变。

宫颈肿瘤；癌前状态；DNA甲基化；α乳头状瘤病毒属；宫颈癌前病变；神经导向因子2

宫颈癌是导致妇女死亡的第4位恶性肿瘤［1］，严重威胁着女性的生命健康。有研究表明超过85%的宫颈癌发生在发展中国家［2］。持续性高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染是导致宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌的主要原因［3］。近二十年来，细胞学检查和HPV检测的筛查方法有效降低了宫颈癌的病死率［4］。但并不是所有感染HR-HPV的妇女都会发展为宫颈癌，还有其他因素参与宫颈癌的发生发展过程。

肿瘤抑制基因的高甲基化会影响基因的正常表达，导致细胞的增殖失控，促进肿瘤的发生发展［5］。已有研究表明，神经导向因子2（SLIT2）基因在宫颈癌前病变和宫颈癌中发生启动子高甲基化［6］。本研究旨在探讨在高危型HPV阳性的人群中定量检测宫颈脱落细胞中SLIT2基因甲基化对于宫颈高级别癌前病变的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2015年9月—2016年3月在天津市中心妇产科医院阴道镜门诊就诊的178例HR-HPV感染者的宫颈脱落细胞，入组同时进行宫颈组织活检，并以组织病理学诊断作为“金标准”。根据病理诊断结果，将178例患者分为正常宫颈组45例、低级别病变组50例、高级别病变组83例。除外妊娠、其他部位的肿瘤、宫颈病变史、放化疗、激素治疗的患者。本研究获医院伦理委员会通过，所有的研究对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器微量样品基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；基因组DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒（Zymo Research）；Dream Taq TM Green Master Mix（Fermentas），紫外可见分光光度计NanoDrop 2000（Thermo）；梯度96孔热循环仪（美国，ABI）；焦磷酸测序仪及相关试剂盒（德国，QIAGEN）；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 DNA提取及化学修饰参照北京天根生化科技有限公司的微量样品基因组DNA提取试剂盒说明进行DNA的提取。参照美国Zymo Research公司EZ DNA Methylation-Gold kitTM试剂盒的说明书步骤，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，修饰后的DNA保存于-20℃备用。

1.2.3 基因扩增PCR所需上游引物为5′-GGGAGGAGGGATTGTTTAGATAT-3′，下游引物为5′-CACCACTCTAAACTCTACTCACT-3′。对下游引物的5′端进行生物素标记。PCR反应条件：95℃预变性15 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40个循环；72℃延伸10 min。完成后反应产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 焦磷酸测序首先需要制备单链DNA模板，然后进行焦磷酸测序反应。SLIT2基因所需测序引物为5′-GAGGATAGGTTTAGGTT-3′。通过Pyro Q-CpG 1.0.9软件可获得SLIT2基因启动子区6个位点的甲基化水平的数据。以每个基因所有检测位点的甲基化率的平均值来表示每份标本的该基因甲基化水平，见图1。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，同一指标的多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用受试者工作特征（ROC）曲线确定SLIT2基因的甲基化对于高级别宫颈癌前病变的诊断阈值。

Fig.1 Detection of SLIT2 gene methylation using pyrosequencing in a sample of HG-CIN图1 采用焦磷酸测序定量检测1例高级别上皮内瘤变中SLIT2基因的甲基化

2 结果

2.1 各组患者临床资料的比较正常宫颈组的平均年龄为（38.40±9.06）岁，低级别病变组为（38.90± 7.93）岁，高级别病变组为（41.14±9.79）岁，3组间年龄差异无统计学意义（F=1.675，P=0.190）。3组的HR-HPV的DNA定量平均值(ng/L)分别为220.01（29.71,698.31）、309.92（4.83,833.64）、385.92（45.19, 1 026.69），3组间差异无统计学意义（H=3.933，P= 0.140）。

2.2 各组患者宫颈病变脱落细胞中SLIT2基因甲基化水平的定量检测正常宫颈组、低级别病变组、高级别病变组的SLIT2基因甲基化水平分别为（4.53±1.37）%，（5.81±2.26）%、（11.80±8.47）%，3组间差异有统计学意义（F=27.61，P＜0.001），多重比较示高级别病变组高于正常宫颈组和低级别病变组（均P＜0.001），正常宫颈组和低级别病变组之间差异无统计学意义（P=0.297）。

2.3 定量检测SLIT2基因甲基化水平诊断高级别宫颈癌前病变的诊断试验结果分析ROC曲线示SLIT2基因甲基化水平诊断高级别宫颈癌前病变的最佳界值为6.41%，此时灵敏度为80.7%，特异度为83.2%，ROC曲线下面积为0.895，见图2。

Fig.2 The ROC curve for the diagnosis of HG-CIN by the quantification of SLIT2 gene methylation图2 SLIT2基因甲基化定量检测在诊断高级别宫颈癌前病变中的ROC曲线

3 讨论

SLIT2基因定位于4p15.2，编码人类与果蝇slit2同源的细胞外基质分泌性糖蛋白，是SLIT基因家族（SLIT1～3）的一员，其主要功能是在中枢神经系统发育过程中调节轴突导向、分支和神经细胞的迁移［7］。已有研究证明，SLIT2基因具有肿瘤抑制活性，且在多种肿瘤中发现了SLIT2基因甲基化［8-13］，SLIT2基因甲基化与其表达呈负相关。Narayan等［6］研究了浸润性宫颈癌及癌前病变中SLIT1、SLIT2、SLIT3、受体Robo1和受体Robo3的表达水平及启动子甲基化的情况，结果表明在浸润性宫颈癌中Slit/ Robo的表达下调、启动子区域存在高度甲基化，并且启动子高甲基化是肿瘤发生的一个早期事件。因此，SLIT2有望作为宫颈癌早期诊断的分子标志物。

宫颈癌的发病过程中有多个基因参与调控，是一个从宫颈不典型增生-原位癌-浸润癌逐渐进展的过程。及时筛查发现高级别宫颈癌前病变是宫颈癌早期诊断和治疗的基本策略。

焦磷酸测序技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，其是基于4种酶催化的酶级联化学发光反应，焦磷酸基团最终转化为可见光的信号的峰值。检测甲基化位点的峰高比，即可反映DNA的甲基化水平。该技术具有高灵活性和易于操作的特性，可以进行大规模测序，实现高通量和自动化，无需进行荧光标记或者染色的核苷酸和引物，也不需要进行电泳，结果准确可靠并且具有较好的可重复性［14］。本研究采用焦磷酸测序技术对178例HR-HPV感染者的宫颈脱落细胞进行定量检测SLIT2基因甲基化状态，发现高级别病变组中SLIT2基因甲基化水平明显高于低级别病变组和正常宫颈组，并且通过绘制ROC曲线确定了定量检测SLIT2基因甲基化水平对于高级别宫颈癌前病变的最佳诊断阈值为6.41%，此时诊断的灵敏度和特异度分别为80.7%、83.2%。这提示定量检测技术在诊断高级别宫颈癌前病变方面具有较好的灵敏度和特异度，具有潜在的临床应用价值。

虽然国内外很多研究都表明持续性HR-HPV感染是发生宫颈癌前病变和宫颈癌的主要原因［4］，但是目前HPV-DNA病毒载量与宫颈病变的严重程度是否存在一定的相关性仍存在争议。第二代杂交捕获技术（HC-2）作为一种HPV-DNA载量半定量测定方法，具有客观性、可重复性、高敏感性和简单操作等优点，已经被广泛应用于临床。一些研究表明，宫颈病变的严重程度与HR-HPV病毒负荷量相关，随着病毒负荷量的增加，宫颈病变的程度越严重，认为高病毒负荷量增加了HPV病毒整合事件的发生［15-16］。同时也有研究认为两者之间并无明显相关性［17］。本研究发现3组不同宫颈病变级别患者之间HPV-DNA病毒载量值差异无统计学意义，并且标准差的范围较大。这提示在宫颈癌前病变和宫颈癌的筛查过程中，HPV-DNA病毒载量水平并不能作为诊断宫颈病变严重程度的指标。

综上，在HR-HPV感染患者的宫颈脱落细胞中，采用焦磷酸测序技术定量检测SLIT2基因的甲基化水平对于高级别宫颈癌前病变的临床诊断灵敏度和特异度较高，具有潜在的应用价值。

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（2016-08-17收稿 2016-09-17修回）

（本文编辑 闫娟）

Diagnostic value of quantitative detection of SLIT2 methylation for cervical high grade precancerous lesion

YUAN Liqin1,HU Yuanjing2△
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Gynecology and Obstetrics,Tianjin Central Hospital△

ObjectiveTo explore the clinical diagnostic value of quantitative detection of the slit homologue 2(SLIT2）methylation for cervical high grade precancerous lesions.MethodsAccording to histopathologic diagnostic results,178 patients infected with high-risk HPV were divided into normal cervix group(n=45),low-grade lesion group(n=50)and highgrade lesion group(n=83).The cervical exfoliated cells were collected in three groups.The methylation levels of SLIT2 were measured by pyrosequencing in three groups.The diagnostic threshold of SLIT2 in high grade precancerous lesions was estimated by receiver operating characteristic(ROC)curve.ResultsThe percentages of SLIT2 methylation were(4.53± 1.37)%,(5.81±2.26)%and(11.80±8.47)%in normal cervix group,low-grade lesion group and high-grade lesion group, respectively.And the differences between three groups were statistically significant(F=27.61,P＜0.001).The percentage of SLIT2 methylation was significantly higher in high-grade lesion group than that of normal cervix group and low-grade lesion group(P＜0.001).There was no significant difference in the percentage of SLIT2 methylation between normal cervix group and low-grade lesion group(P=0.297).The area under the ROC curve was 0.895 and optimal cut-off value was 6.41%.The sensitivity and specificity were 80.7%and 83.2%,respectively for the detection by SLIT2 methylation.ConclusionThe quantitative detection of SLIT2 gene methylation level in cervical exfoliated cells by pyrosequencing can effectively diagnose cervical high grade precancerous lesions.

uterine cervical neoplasms;precancerous conditions;DNA methylation;alphapapillomavirus;cevical precancerous lesions;slit homologue 2

R711.74

A

10.11958/20160854

天津市卫生局科研课题资助项目（13KG134）

1天津医科大学（邮编300070）；2天津市中心妇产科医院

袁立芹（1987），女，硕士在读，主要从事妇科肿瘤方向研究

△通讯作者E-mail:tdjhyj@hotmail.com