雄激素、雌激素受体在尿道下裂患儿阴茎皮肤中的表达

赵林胜，陈子英，许海华，郎荣容，胡晓丽，徐国栋

雄激素、雌激素受体在尿道下裂患儿阴茎皮肤中的表达

赵林胜，陈子英，许海华，郎荣容，胡晓丽，徐国栋△

目的 探讨雄激素受体（AR）及雌激素受体（ER）在尿道下裂患儿阴茎不同部位表皮及真皮中的分布特点。方法收集30例尿道下裂患儿阴茎背侧皮肤（背侧组）、异位尿道口腹侧皮肤（腹侧组）及尿道板皮肤组织（尿道板组），应用免疫组织化学检测各组中AR和ER在表皮和真皮成纤维细胞中的表达情况，Image Pro plus 6.0分析AR和ER在不同部位的表皮和真皮中的光密度（OD）值。结果各组AR、ER主要表达于阴茎皮肤基底细胞及棘细胞的细胞核，也表达于真皮成纤维细胞的细胞核。AR在表皮中的表达，尿道板组低于背侧组和腹侧组（P＜0.05）；各组AR在真皮成纤维细胞中的表达差异无统计学意义。ER在表皮中的表达，背侧组高于腹侧组和尿道板组（P＜0.05）；ER在真皮成纤维细胞中的表达，背侧组、腹侧组和尿道板组呈依次升高趋势（P＜0.05）。结论阴茎尿道板组织中AR表达数量减少在尿道下裂发生中起重要作用，阴茎皮肤真皮成纤维细胞中ER表达的失衡可能参与了尿道下裂的发生。

尿道下裂；受体，雄激素；受体，雌激素；儿童发育

尿道下裂是小儿泌尿生殖系统最常见的畸形之一，在新生男婴中发病率高达0.4%［1］。研究显示，随着环境恶化及低体质量患儿存活率的提高，尿道下裂发病率呈逐年增高趋势［2］。正常尿道的形成需要体内雄激素与雌激素水平之间的平衡，性激素作用的失衡为尿道下裂形成的重要影响因素［3］。雄激素受体（androgen receptor,AR）和雌激素受体（estrogen receptors,ER）为性激素发挥效应的关键环节，AR和ER在尿道下裂皮肤中的表达与尿道下裂的关系尚无定论。本研究通过分析尿道下裂患儿阴茎不同部位的表皮和真皮成纤维细胞中AR和ER的表达情况，探讨其与尿道下裂的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源选取2012年6月—2015年12月天津市儿童医院收治的先天性尿道下裂男性患儿30例，年龄1～5岁，平均（2.5±0.8）岁；采集尿道下裂患儿阴茎背侧包皮（背侧组）、异位尿道口腹侧皮肤（腹侧组）及尿道板组织（尿道板组）。所有标本采集不影响患儿手术并经本院伦理委员会批准，患者家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器鼠抗人AR和ER单克隆抗体（北京中杉金桥有限公司），通用HRP-DAB显色试剂盒（罗氏公司）；BX51生物显微镜（Olympus公司）；Motic3.0图像采集系统（麦克奥迪厦门有限公司）；Benchmark XT全自动免疫组化仪（罗氏公司）。

1.3 免疫组化染色标本经4%的中性甲醛充分固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后4 μm切片，65℃烤片1 h后，采用Benchmark XT全自动免疫组化仪染色。用已知阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲溶液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果观察AR和ER阳性定义为细胞核出现棕黄色颗粒。Image Pro Plus 6.0软件分析AR和ER在不同部位的表皮和真皮中的光密度（OD）值。

1.5 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR、ER的表达定位在阴茎皮肤不同部位表皮和真皮中，真皮成纤维细胞AR表达差异不明显；AR、ER主要表达于鳞状上皮基底细胞及棘细胞的细胞核，也表达于真皮成纤维细胞的细胞核，见图1。

2.2 各组阴茎皮肤中AR和ER表达尿道板组表皮中AR的表达低于背侧及腹侧组，ER的表达低于背侧组（P＜0.05）。AR在各组真皮成纤维细胞中的表达差异无统计学意义。背侧组、腹侧组和尿道板组真皮成纤维细胞中ER的表达呈依次升高趋势（P＜0.05），见图1、表1。

Tab.1 Comparison of AR and ER between three groups of epidermis and dermis表1 各组AR和ER在表皮和真皮中的表达情况比较（n=30，OD值×103，）

Tab.1 Comparison of AR and ER between three groups of epidermis and dermis表1 各组AR和ER在表皮和真皮中的表达情况比较（n=30，OD值×103，）

＊＊P＜0.01；a与背侧组比较，b与腹侧组比较，P＜0.05

AR表皮418.17±23.56 397.47±49.33 245.30±29.38ab208.200＊＊组别背侧组腹侧组尿道板组F真皮153.29±29.11 145.53±32.05 139.22±26.51 1.980 ER表皮335.21±26.34 211.52±33.15a197.22±24.50a216.500＊＊真皮98.73±25.35 115.73±22.23a175.25±24.51ab86.630＊＊

3 讨论

3.1 尿道下裂阴茎不同部位皮肤中AR的表达尿道下裂发病机制复杂，已有研究表明尿道的形成是一个性激素依赖的过程，环境因子、遗传因素及性激素失衡可导致性激素作用的偏差［2］。通常情况下，雄激素通过与尿道组织上的AR结合发挥效应，因而AR的异常与尿道下裂的发生密切相关。

本研究结果显示，尿道下裂患儿皮肤中AR主要表达于表皮基底层及棘细胞的细胞核，且尿道下裂患儿尿道板组织表皮中AR的表达低于阴茎背侧及腹侧皮肤，此结果与安宇等［4］报道的部分结果一致，后者应用免疫组化分析25例尿道下裂患儿及18例包皮环切患者的阴茎皮肤，发现先天性尿道下裂及单纯性阴茎下曲阴茎皮肤组织中AR的表达低于包皮环切组阴茎皮肤，尿道板皮肤中AR的表达降低尤为突出，近端型尿道下裂阴茎背侧、腹侧皮肤AR的表达低于远端和中段型尿道下裂，而不同类型尿道下裂尿道板中AR的表达差异无统计学意义，但该研究未对AR在真皮成纤维细胞中的表达情况进行独立分析。Baskin等［5］研究结果显示，尿道下裂组阴茎皮肤中AR mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常人组；认为AR与DNA结合能力及功能的下降可导致尿道下裂阴茎皮肤中AR mRNA代偿性表达增多。林俊山等［6］研究显示，在不同类型的尿道下裂尿道板中，单独应用生理水平的睾酮时，中远端型尿道下裂组与对照组（低端型尿道下裂）AR差异无统计学意义；而提高睾酮水平后，中远端型尿道下裂组AR的活化水平低于对照组；同时应用表皮生长因子和生理水平的睾酮时，近端型和远端尿道下裂组的成纤维细胞AR的活化水平较对照组明显升高，认为尿道下裂尿道板成纤维细胞AR的表达与活化均存在异常。本研究结果提示尿道板表皮中AR表达降低可能为尿道下裂的致病因素之一。本研究中AR在不同部位真皮成纤维细胞中的表达差异无统计学意义，考虑可能与不同严重程度尿道下裂中真皮成纤维细胞AR的表达数量或AR的功能异常不尽一致有关。

3.2 尿道下裂阴茎不同部位皮肤中ER的表达与AR比较，ER在对生殖结节中的细胞分裂、细胞凋亡、纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、Wnt信号传导通路等多种调控中起相反的作用，但AR和ER的信号同时影响阴茎发育［7］。Walker等［8］利用基因敲除技术敲除鼠的ERα、β基因及芳香化酶基因后，发现被覆上皮的间充质相互融合，形成尿道口和包皮，此过程依赖雄激素和雌激素信号共同作用，且雌激素信号显得更为重要。Cunha等［9］的动物实验研究表明，在尿道形成过程中雌激素可促进上皮的融合，决定尿道口组织的弹性；相反，应用来曲唑抑制雌激素合成，可导致尿道下裂及阴茎头畸形，且雌激素的合成障碍与阴茎的ER表达水平有关。Qiao等［10］应用RT-PCR和免疫组化分析35例尿道下裂和15例正常包皮环切阴茎皮肤中ER的表达，RTPCR结果发现尿道下裂阴茎皮肤中ERα和ERβ mRNA的表达均明显降低，且与尿道下裂的程度无关；免疫组化分析显示ERβ主要表达于表皮的基底层和棘细胞层，ERα弱表达于正常和中度尿道下裂的阴茎皮肤，在重度尿道下裂中未检测到ERα的表达。因此该研究认为，尿道皮肤中ER的表达下降参与尿道下裂的发生。本研究结果显示，阴茎尿道板和腹侧表皮中ER表达低于阴茎背侧皮肤，结果与上述报道一致。本研究同时发现，背侧组、腹侧组和尿道板组真皮成纤维细胞中ER的表达水平依次升高。研究认为，在阴茎的发育过程中，ER信号的增强可抑制阴茎的发育，成纤维细胞中ER表达增高可能抑制尿道板成纤维细胞的增殖，导致尿道板的发育迟缓，从而导致尿道下裂的发生［5］。因此，结合相关研究，笔者认为，皮肤真皮成纤维细胞中ER表达增高可能为尿道下裂的重要致病机制，保留尿道板的尿道成形术后局部激素干预方案值得进一步研究。

通常情况下，尿道板生长较阴茎的其他部位生长发育迟缓，为尿道下裂患儿阴茎下弯及尿道口异位的组织学基础；AR和ER表达的失衡可能为尿道下裂发生的重要作用机制。在众多的尿道下裂矫形方法中，保留致AR和ER表达失衡的尿道板的术式，术后尿道瘘并发症发生率可达38%［11］。然而，最近的Meta分析6项研究发现，仅1项研究显示术前激素干预能有效降低并发症，4项研究显示术前激素干预后并发症发生率升高，余1项研究未显示有差异［12］。Chao等［13］研究则显示，术前激素干预不会提高术后并发症的发生率。因此，是否需要根据尿道下裂局部皮肤性激素受体失衡的特点，行个体化的精准的激素干预，值得进一步探讨。

（图1见插页）

［1］Boudaoud N，Pons M，Bouche Pillon Persyn MA，et al.Hypospadias［J］.Ann Chir Plast Esthet，2016，61（5）：439-449.doi:10.1016/j. anplas.2016.03.007.

［2］Shih EM，Graham JM Jr.Review of genetic and environmental factors leading to hypospadias［J］.Eur J Med Genet，2014，57（8）：453-463.doi：10.1016/j.ejmg.2014.03.003.

［3］Zhang GL，Zhang JM.Advances in etiology of hypospadias［J］.Chin J Pediatr Surg，2014，35（3）：230-232.［张干林，张金明.尿道下裂病因学研究进展［J］.中华小儿外科杂志，2014，35（3）：230-232］.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2014.03.017.

［4］An Y，Liu XH，Tang YM，et al.Expression of androgen receptor in genital tissue of patients with congenital hypospadias and simple chordee［J］.Chin J Repar Reconst Surg，2012，26（4）：461-465.［安宇，刘雪辉，唐耘熳，等.先天性尿道下裂和单纯性阴茎下曲患者阴茎皮肤组织中雄激素受体表达研究［J］.中国修复重建外科杂志，2012，26（4）：461-465］.

［5］Baskin L.Quantitative measurement of the androgen receptor in prepuces of boys with and without hypospadias［J］.BJU Int，2013，112（2）：159-160.doi:10.1111/j.1464-410X.2012.11783.x.

［6］Lin JS，Xie C，Chen RQ，et al.Effect of epidermal growth factor and testosterone on androgen receptor activation in urethral plate fibroblasts in hypospadias［J］.Journal of Central South University（Medical Sciences），2016，41（5）：507-512.［林俊山，谢承，陈瑞庆，等.表皮生长因子及睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体活化水平的影响［J］.中南大学学报（医学版），2016，41（5）：507-512］.doi:10.11817/j.issn.1672-7347.2016.05.010.

［7］Zheng Z，Armfield BA，Cohn MJ.Timing of androgen receptor disruption and estrogen exposure underlies a spectrum of congenital penile anomalies［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（52）：E7194-7203.doi:10.1073/pnas.1515981112.

［8］Walker VR，Jefferson WN，Couse JF，et al.Estrogen receptor-α mediates diethylstilbestrol-induced feminization of the seminal vesicle in male mice［J］.Environ Health Perspect，2012，120（4）：560-565.doi:10.1289/ehp.1103678.

［9］Cunha GR，Risbridger G，Wang H，et al.Development of the external genitalia：perspectives from the spotted hyena（Crocuta crocuta）［J］.Differentiation，2014，87（1/2）：4-22.doi:10.1016/j. diff.2013.12.003.

［10］Qiao L，Rodriguez E Jr，Weiss DA，et al.Expression of estrogen receptor alpha and beta is decreased in hypospadias［J］.J Urol，2012，187（4）：1427-1433.doi:10.1016/j.juro.2011.12.008.

［11］Khan M，Majeed A，Hayat W，et al.Hypospadias repair:a single centre experience［J］.Plast Surg Int，2014，2014：453039.doi: 10.1155/2014/453039.

［12］Wong NC，Braga LH.The influence of pre-operative hormonal stimulation on hypospadias repair［J］.Front Pediatr，2015，3：31. doi:10.3389/fped.2015.00031.

［13］Chao M，Zhang Y，Liang C.Impact of pre-operative hormonal stimulation on post-operative complication rates after hypospadias repair：a meta-analysis［J］.Minerva Urol Nefrol，2016 May 10.［Epub ahead of print］.

（2016-07-19收稿 2016-10-16修回）

（本文编辑 陆荣展）

Distribution of androgen receptor and estrogen receptor in penis skin of patients with hypospadias

ZHAO Linsheng,CHEN Ziying,XU Haihua,LANG Rongrong,HU Xiaoli,XU Guodong△
Department of Pathology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300384,China△

ObjectiveTo characterize the expressions of androgen receptor(AR)and estrogen receptor(ER)in penis skin of patients with congenital hypospadias.MethodsDorsal prepuce,ventral prepuce,and urethral plate were harvested from 30 patients with congenital hypospadias.The expressions of AR and ER in epidermal cells and dermal fibroblasts were assessed respectively by automated immunohistochemistry.Image Pro plus 6.0 was used to analyze the optical density(OD) value of AR and ER in different parts of epidermal cells and dermal fibroblasts.ResultsAR and ER were located mainly in nucleis of the squamous basal cells and prickle cells,and were also found in nucleis of subcutaneous fibroblast cells.The expression of AR was lower in epidermis of urethral plate than that of dorsal prepuce and ventral prepuce(P＜0.05),but no significant difference was detected in dermal fibroblasts.The expression of ER was higher in epidermis of dorsal prepuce than that of urethral plate and ventral prepuce(P＜0.05).The dermal expression of ER in fibroblast cells was increased successively in dorsal prepuce,ventral prepuce and urethral plate(P＜0.05).ConclusionLower expression of AR in urethral plate may contribute the development of hypospadias.Disorder of ER in dermal fibroblast cells of prepuce may play an important role in hypospadias.

hypospadias；receptor,androgen；receptor,estrogen；child development

R695.3

A

10.11958/20160701

天津市卫生计生委资助项目（2011ky13）

天津市儿童医院病理科（邮编300384）

赵林胜（1978），男，硕士，主要从事儿童病理诊断

△通讯作者E-mail:dongyan615@163.com