饲料中添加N-氨甲酰谷氨酸对中间球海胆成胆生长、性腺发育、消化酶活力和免疫性能的影响

■ 左然涛 李 敏 李 广 吴反修 常亚青 范文涛

（1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023；2.全国水产技术推广站中国水产学会，北京100122；3.亚太兴牧科技有限公司，北京100193）

中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）原产于日本北海道和俄罗斯远东沿海，由于其性腺色泽好、味甜，在国际市场广受欢迎。1989年，大连海洋大学将其引入中国，现已成为我国北方重要的海水养殖品种。海带、裙带菜、石莼是海胆养殖的主要饵料来源。但是，鲜活生物饵料供应极不稳定，尤其是每年夏季高温季节，只能以干品替代，且高温期极易腐烂变质，这严重降低了海胆的成活率、摄食量和生长速率。配合饲料因其原料来源广泛、营养搭配均衡、饲料利用率高成为海胆养殖产业获得突破性发展的关键。目前，配合饲料在北方球海胆（S.droebachiensis）、加州红海胆（S.franciscanus）、Evechinus chloroticus和中间球海胆（S.intermedius）亲胆中已有报道，结果表明配合饲料在降低饵料系数，提高海胆性腺指数和营养品质方面具有生物饵料无可比拟的优势。

精氨酸对水产动物免疫促进作用的研究已有较多报道，其中精氨酸代谢产生的一氧化氮（NO）被认为在免疫信号转导过程中发挥着重要作用。此外，陆生动物中的研究表明饲料中添加精氨酸能够提高性腺发育和产仔数量。但是，目前精氨酸价格昂贵，不适合规模化饲料生产使用。N-氨甲酰谷氨酸（NCG）由于价格低廉且具有精氨酸相似的生理功效成为较为理想的精氨酸替代物。陆生动物中的研究表明，NCG可有效激活氨甲酰磷酸合成酶，提高动物体内精氨酸的合成速率，从而提高断奶仔猪的生长速率，改善母猪的繁殖性能以及公猪的精液质量。但NCG对水产动物生理影响的研究鲜见报道。因此，本研究以中间球海胆为研究对象，探讨了饲料中添加NCG对海胆生长、性腺发育、消化酶活力和免疫性能的影响，以期为海胆促熟期间配合饲料中NCG的添加提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 饲料配制

以海藻粉和豆粕为主要蛋白源，鱼油和豆油为主要脂肪源，通过梯度添加NCG配制6种等氮（粗蛋白，21%；粗脂肪，4%）的试验饲料，使饲料NCG水平依次为0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、1.00%（配方见表1）。所有粉状原料粉碎后过100目筛，并按照配比将饲料干粉进行充分混合，然后将鱼油、豆油和卵磷脂的混合物均匀添加至上述干粉饲料中。随后，向加过油的原料中添加30%自来水并利用混匀机充分混合均匀。利用制粒机制粒（3 mm×3 mm）。制作好的饲料于40℃烘箱烘干，冷却后用双层塑料袋包装，储存于阴凉干燥处备用。

表1 饲料配方(%饲料干物质)

1.2 试验动物

本试验所需的2龄中间球海胆购自大连旅顺龙王塘某养殖场，试验开始前将其放置于1 000 L的水槽中进行暂养，每天换水和投喂配合饲料1次（17∶00），换水比例为总体积的50%。经过2周驯化，将大小均匀、健康无病的海胆[初始体重：(62.0±1.4)g]分养至21个网笼（直径15 cm，高20 cm）中，试验网笼挂放在1 000 L蓝色玻璃钢水槽中，每个网笼投放20只海胆。每种饲料分别随机投喂三个网笼的海胆，另有三个网笼投喂海带作为对照。

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1.3 养殖管理

Nfi和Nft——分别是摄食生长试验初期和末期试验海胆的数目；

1.4 消化酶活力测定

支气管热成形术(bronchial thermoplasty, BT)通过射频消融支气管平滑肌(airway smooth muscle, ASM)用于支气管哮喘的治疗，但主要针对难治性支气管哮喘，目前已在国内外进行了一些试验研究，并取得了初步的临床效果，现综述如下。

1.5 免疫相关酶活力测定

海胆体腔液免疫相关酶活力采用南京建成试剂盒进行测定。超氧化物歧化酶（SOD）活力定义为每毫升体腔液中SOD抑制率达50%时多对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）；过氧化氢酶（CAT）活力定义为每毫升体腔液每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活力单位；谷胱甘肽-S转移酶（GST）活力定义为每毫升体腔液在37℃反应1 min，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/l为一个酶活力单位；碱性磷酸酶（AKP）的活力定义为每毫升体腔液在37℃条件下15 min产生1 mg酚为一个活力单位。

1.6 计算和统计方法

持续长度是该模型的一个基本参数.持续长度与自由旋转链的处理方法有异曲同工之妙,因为二者都采用了后键依次在前一键上投影并依此前推至所需键的计算方法.自由旋转链因为需要所有键之间进行两两点乘,因此其平均范围广,需要大量样本的统计平均方可采用投影法进行平均处理.持续长度涉及的是各个键在第一个键方向上投影,一旦键的方向与第一个键相反,它在z轴方向的投影就是负值.经平均处理后,负值就不再出现,代之以收敛于0的投影值.因此,持续长度的计算同样应该是大量连接单元的统计平均值.

将-80℃保存的肠道在冰上解冻，按重量（g）∶体积（ml）=1∶9比例加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，冷冻离心（4 ℃，2 500 r/min）10 min后留取上清液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、总蛋白含量测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。利用Epoch酶标仪（美国Biotek公司）对显色溶液吸光度进行测定。其中，每毫克组织蛋白，37℃下，每分钟分解蛋白生产1 μg氨基酸相当于1个胃蛋白酶活力单位；每毫克蛋白在37℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位；在37℃条件下，每克组织蛋白与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个脂肪酶活力单位。

试验在大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室进行，试验周期为56 d。试验期间，每天换水一次，换水比例为玻璃钢水槽容积的50%。换水时吸底，以清除水槽底部的残饵和粪便，每次换水后投喂配合饲料（17∶00）。试验期间，溶氧＞5 mg/l，水温保持在（15±2）℃，盐度为28～30。摄食生长试验结束后，对每个网笼中的海胆进行计数并称重，每个网笼取6只海胆，解剖并称量性腺以计算性腺指数，分离消化道并收集于1.5 ml离心管中，用1 ml注射器吸取体腔液，离心5 min（4 ℃，3 000 r/min），将上清液移至新的1.5 ml离心管，消化道和体腔液上清液氮速冻后保存于-80℃备用。

针对局部给药方面，有临床相关研究者提出[5] ，通过将不同剂量紫杉醇涂层支架，植入至猪心的冠脉左前降支部位，经1个月后行冠状动脉造影，结果发现不同组的新生内膜面积，会随着紫杉醇剂量的不断增加呈减少趋势。针对全身给药方面研究，有临床研究学者提出，通过将不同剂量紫杉醇（微粒型），注入兔双侧骼动脉的内部剥落部位，剂量较高的一组相较剂量较低的一组，新生内膜皮平均厚度明显较低。

G——海胆性腺的重量(g)。

摄食配合饲料和海带的海胆在蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶方面未见显著性差异，说明配合饲料可被海胆很好地接受并利用。NCG的添加并未显著影响中间球海胆肠道消化酶活力（P＞0.05）。从生长指标来看，NCG的添加未对海胆生长速率产生显著影响，这也可能与NCG未改变海胆消化酶活力有关。

2 试验结果

2.1 饲料中添加NCG对中间球海胆成活率、增重率和性腺发育速率的影响（见表2）

表2 饲料中添加NCG对海胆成胆生长和性腺指数的影响

海带处理组海胆体腔液SOD和CAT活力显著高于未添加NCG饲料组，而添加NCG不同程度提高了海胆体腔液中SOD和CAT的活力。随着饲料中NCG添加量的升高，海胆SOD和CAT活力呈先升高后下降的趋势，当NCG添加量为0.12%和0.16%时，海胆分别具有最高SOD活力和最高CAT活力，显著高于未添加NCG处理组（P＜0.05）。过量添加NCG（1%）有降低海胆SOD和CAT活力的趋势（P＞0.05）。海胆体腔液中GST和AKP活力在各饲料组间差异不显著（P＞0.05）。

式中：Wf和Wi——分别是海胆平均末重和平均初重(g)；

2.2 饲料中添加NCG对中间球海胆消化酶活力的影响（见表3）

试验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，在单因素方差分析达到显著水平时（P＜0.05），采用Turkey's检验进行多重比较，数据表示为“平均值±标准误”的形式。

2.3 饲料中添加NCG对中间球海胆免疫性能的影响（见表4）

表3 饲料中添加NCG对海胆成胆消化酶活力的影响(U/mg Pro)

表4 饲料中添加NCG对海胆成胆免疫性能的影响(U/ml)

中间球海胆的成活率均大于90%，且各处理组之间差异不显著（P＞0.05）。饲料中添加NCG对海胆的终末体重和增重率均未产生显著影响（P＞0.05）。配合饲料组海胆性腺指数均高于海带组，随着饲料中NCG添加量的升高，海胆性腺指数显著升高，并当NCG添加量为0.12%时具有最大值（14.76%），与0.16%和1.0%NCG组差异不显著，但显著高于NCG未添加组和低添加量组（0.04%～0.08%）的性腺指数（P＜0.05）。

阀厅屋盖上的单轨吊车及悬挂设备荷载如图2所示。屋盖上设置7座单轨吊车，计算时考虑2座吊车同时运行。设备荷载按照集中荷载考虑，位置按实布置，每处吊点集中荷载标准值20 kN。

3 讨论

3.1 饲料中添加NCG提高了海胆性腺指数

本研究中，饲料中添加0.12%的NCG能显著提高海胆的性腺指数。这与陆生动物中的研究结果相一致。饲料中添加0.1%的NCG显著提高了母猪所产仔猪的数量和出生重量。这可能是由于NCG能够促进精氨酸的内源性合成，从而间接增加日粮中精氨酸含量。已有研究证明饲料中添加1%的精氨酸能够显著提高母猪每窝活仔数和出生体重。此外，精氨酸在体内分解代谢过程中会产生多氨。多氨在DNA和蛋白质合成中起调控作用，因此也调控着机体的细胞增殖和分化，进而促进性腺组织的分化和增长。

3.2 饲料中添加NCG促进了海胆非特异性免疫力

本研究中，与不添加NCG饲料组相比，添加NCG显著提高了海胆体腔液中SOD和CAT活力，且与海带处理组具有相当的水平。杨平等发现饲料中添加0.1%或1.0%NCG显著提高了妊娠期母猪的免疫力。精氨酸已被证实在多种陆生动物中发挥免疫促进作用，尤其是当动物机体处于亚健康状态时这种免疫促进作用更为显著。在水产动物中研究相对较少，Buentello等研究发现2%～4%精氨酸能够显著提高斑点叉尾鮰的免疫力和抗病力。Cheng等发现精氨酸能够提高美国红鱼和杂交条纹鲈的免疫力。有关精氨酸调控机体免疫性能机制的研究已有诸多报道，其中精氨酸体内代谢产物NO被公认为参与动物免疫反应。NO是动物体以精氨酸为底物在NO合成酶的作用下合成的，Ferid Murad因其发现NO作为信号分子具有松弛平滑肌细胞和扩张血管的作用被授予诺贝尔生理学奖。NCG是精氨酸内源合成途径中关键酶（CPS-1）的有效激活剂，能增加精氨酸的内源合成，从而通过精氨酸间接发挥免疫调控作用。

4 结论

饲料中添加NCG并未改变中间球海胆生长速率和消化酶活力，但却显著影响了其性腺发育速率和免疫性能。综合性腺发育和免疫指标，推荐中间球海胆成胆配合饲料中NCG的添加量为0.12%～0.16%饲料干物质。

（参考文献刊略，需者可函索rtzou@dlou.edu.cn）