TMR青贮中存在的乳酸菌对意大利黑麦草青贮的发酵品质和有氧稳定性的影响

■王 超 西野直树 金 海 薛树媛

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.日本冈山大学自然科学研究科动物生产学学院，日本冈山，700-8530）

青贮的有氧变败是指青贮里面附着或残存的酵 母菌、霉菌以及需氧菌，随着青贮的开封因为空气的进入而恢复活性，利用青贮中残存的糖类、发酵过程中生成的乳酸、醋酸等作为能源物质迅速增殖，并且把这些物质分解为CO2和水，同时释放出大量的热，使青贮的温度升高的现象。同时，由于酸类被消耗，蛋白质和氨基酸的分解，产生氨气，使青贮中的pH值升高，因此，青贮中酵母、霉菌以及需氧菌残存数量多的时候，更容易发生有氧变败[1]。青贮饲料开封后发生有氧变败，大量的糖、乳酸和氨基酸发生分解，使干物质含量减少，通常减少量在2%～11%，变败严重的能达到30%[2-4]。由于有氧变败而使营养价值和适口性都下降，从而使乳牛的采食量和产乳量都下降。而且青贮在发生有氧变败后，经常有青霉菌、红曲霉菌、黄曲霉菌和毛霉菌等真菌类出现，这些真菌会产生红曲霉毒素、黄曲霉毒素等各种毒素，使乳牛出现下痢，甚至中毒死亡等，严重影响了乳牛的健康和生产。另外，霉菌毒素在动物体内很难代谢分解，将继续排泄到乳制品中，最终危害人类健康。所以，青贮饲料开封后如何抑制有氧变败，一直是一个课题。为了解决青贮饲料开封后的有氧变败的问题，科学家发明了很多种类的添加剂，有化学制剂、抗生素、微生物制剂等。

化学制剂如甲酸、丙酸、丙酸盐、己酸、山梨酸以及氨气等，对青贮具有不同程度的抑制变败的作用[1]。化学物质的使用，具有成本高、不容易普及的特点。抗生素的添加也可以抑制青贮的变败，但是由于成本比化学制剂还要高，而且从2006年开始EU（欧洲联盟）规定：禁止任何治疗以外的抗生素物质作为添加剂类在畜禽饲料中使用。因此，抗生素的使用在青贮生产中实际应用的很少。而乳酸菌制剂不仅可以改善青贮饲料的发酵品质，还可以增加奶牛的产乳量。因此，乳酸菌制剂一直备受关注。到现在为止，Ranjit、Kleinschmit、Tay⁃lor、Nishino等发现在加工青贮时添加乳酸菌Lactobacil⁃lus buchneri，青贮饲料开封后具有强效抑制有氧变败的作用[5-11]。关于乳酸菌制剂的添加量，Moon等的研究表明，一般材料附着乳酸菌数量为103～104cfu/g，添加菌制剂要达到106cfu/g，成为优势菌种时，可以抑制其它杂菌的生长发育，从而改善青贮的发酵品质，因此，现在青贮加工时乳酸菌的添加量都为鲜草重的106cfu/g[12]。在Nishino等的研究表明全混合青贮饲料（简称TMR青贮）开封后，在空气中放置7 d也不发生有氧变败，利用培养（活菌分离法）和非培养（PCR-DGGE法）的方法对TMR青贮中的细菌和细菌群态进行解析，既在TMR青贮中分离出了L.buchneri，又在PCR-DGGE图谱中确认出了L.buchneri的菌体DNA，因此认为TMR青贮不发生有氧变败跟L.buchneri有很大关系[13-15]。而王超等利用PCR-DGGE图谱对日本全国各地市场销售的大量的TMR青贮的微生物群态分析后，在TMR青贮中未发现L.buchneri，由此得出L.buchneri不是保持TMR青贮不发生有氧变败的唯一原因。

TMR青贮中出现了在普通牧草青贮中未被报道过的乳酸菌类如：Lactobacillus panis、Lactobacillus fru⁃menti、Lactobacillus raffinolactis、Lactobacillus vacci⁃nostercus、Lactobacillus oris、Lactobacillus acetotoler⁃ans、Lactobacillus farciminis和Lactobacillus mindensis等。在夏秋季节生产的TMR青贮中共同存在Lactoba⁃cillus acetotolerans、Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus farciminis等菌，这几株菌最先是从一种叫做“发面引子”中的分离得到的乳酸菌类[16-17]，“发面引子”也是一种不容易发生变败的物质[18]，因而，推测这类“发面引子”乳酸菌类对于抑制有氧变败有一定的作用。由于“发面引子”乳酸菌存在于夏秋季节加工生产的发酵TMR青贮中，我们认为“发面引子”乳酸菌类适宜在较高的温度下生长。由于市售发酵TMR青贮一般的存放期间为2个月左右基本全部出售，因此，本试验在25℃和35℃时，选择发酵TMR青贮中存在的“发面引子”乳酸菌类Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti和Lactobacillus farciminis对意大利黑麦草进行添加并且存放2个月，验证“发面引子”乳酸菌类对于意大利黑麦青贮饲料发酵品质、有氧变败和微生物群态的影响。

1 材料和方法

1.1 添加剂用乳酸菌的冻干干燥粉末的制备

Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti和Lac⁃tobacillus farciminis由日本理化研究所购进。利用MRS液体培养基复活培养，经过3次纯化培养后，将菌液以8 000 r/min的速度进行离心15 min，去上清液后在沉淀物中加入10%（w/v）脱脂乳摇匀，利用真空冷冻干燥机冷冻干燥制成粉末，对回收粉末在添加试验之前利用MRS固体培养基进行活菌数测定，以便确定制作青贮时的添加量。

1.2 添加试验

在意大利黑麦草的头茬草的出穗期收割，预干8 h候后用铡草机切断为2～3 cm的小段。取冻干的菌制剂粉末用自来水溶解制成为0.5×109cfu/ml菌液，以2 ml/kg的量添加到鲜草中作为试验组，以添加相同量自来水的鲜草作为对照组，充分混合后取500 g左右装入青贮专用袋中，利用抽真空机抽成真空并密封。每个添加做3个重复，分别置于25℃和35℃温箱中贮存2个月。

1.3 测定内容

活菌数、干物质含量、pH值、乳酸、挥发性脂肪酸、酒精等含量、微生物群态、有氧变败等。

1.3.1 活菌数

在无菌状态下开封称取20 g青贮饲料，加入180 ml灭菌生理食盐水（0.90%）4℃恒温冰箱中放置30 min，充分振荡后取1 ml原液，加入9 ml灭菌生理食盐水中，按照梯度稀释法依次稀释到10-6。乳酸菌用MRS固体培养基；酵母和霉菌用YM固体培养基进行培养计数。

1.3.2 干物质

取青贮样品在60℃烘干箱内干燥48 h，烘干完成后在空气中放置30 min后称重测定其干物质含量。

1.3.3 pH值、挥发性脂肪酸含量

取20 g青贮饲料加入180 ml蒸馏水，利用榨汁机榨1 min，用2层医用纱布过滤后，再用滤纸过滤，滤液用电极式pH计测定pH值。乳酸、挥发性脂肪酸、酒精用HPLC测定。HPLC是用测定有机酸离子交换柱（ICSeq COREGEL-87H column,Tokyo Chemical In⁃dustry Co.,Tokyo,Japan），0.004 mol/l H2SO4作为流动相，流速为0.6 ml/min，柱温度为60℃，青贮水溶液经0.20 μm的滤器过滤后，取10 μl进行分析。

1.3.4 微生物群态测定

利用PCR-DGGE的方法分析测定：利用试剂盒（DNeasy Tissue Kit，QIAGEN，Maryland，USA）从青贮样品中提取出细菌和真菌DNA，细菌DNA的PCR是在16S rRNA的V3领域为对象，引物为GC357f(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 517r(5’-AT⁃TACCGCGGCTGCTGG-3’)。PCR混合液为：20 mmol/l Tris-HCl(pH 值9.3)，50 mmol/l KCl，2.0 mmol/l MgCl2，0.2 mmol/l dNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶（TaKaRa Bio Inc.,Japan)。PCR的条件为：95℃ 10 min预热，93℃3 s变性，65℃、60℃以及55℃ 30 s的退火，72℃1 min的延伸。退火每个温度为10个循环，采用温度渐降式的降落PCR方法（Pedro等，2001）。真菌DNA的PCR是18S rRNA领域为对象，NS3（5’-CGCCCGCC⁃GCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3’）和 YM951r（5’-TTGGCAAATGCTTTCGC-3’）为引物扩增的。PCR的混合液与细菌DNA的PCR相同，PCR条件为95℃预热10 min，93℃变性1 min，55℃、50℃以及45℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。

DGGE(变性梯度凝胶电泳)是利用BioRad的DCode系统,丙烯酰胺的浓度为10%(w/v),变性剂浓度为20%～50%(细菌)和20%～30%（真菌）,电泳条件为60 ℃、150V、12 h，用SYBR Green l（Cambrex BioScience lnc,Rock⁃land,ME）染色DNA后，在紫外线灯光下拍照分析。

1.3.5 青贮开封后有氧变败的测定

贮存2个月后的青贮开封时取一半样品做各类分析，取剩余料中的150 g放入500 ml的塑料瓶中，每个瓶内设置连续测温仪器，样品温度高于室温2℃时判断为变败。对开封放置7 d的样品也回收，与开封时一样测定活菌数、干物质含量、pH值、乳酸、挥发性脂肪酸、酒精等含量、微生物群态等。

1.3.6 统计分析

统计处理是用JMP（ver.7,SAS Institute,Tokyo,Japan）进行分析的。乳酸菌和贮存温度作为因素进行二元分散分析，包括交叉作用进行要素分析。关于乳酸菌的添加菌种的不同，进行了Tukey的多重分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

意大利黑麦草原料中的成分和菌落数量如表1所示，由于进行了预干,意大利黑麦草的DM为500 g/kg,原料草附着的乳酸菌数较少，相对于酵母菌以及大肠菌为105cfu/g的水平，乳酸菌只有103cfu/g。

表1 意大利黑麦草原料中化学物质含量和菌落数量

贮存2个月后的青贮中发酵产物和活菌数如表2所示。

在25℃和35℃贮存时,高温贮存青贮的干物质含量极显著性高于低温贮存青贮(P＜0.01),而相同温度贮存的青贮干物质含量,添加组和对照组没有显著性差异。不同温度贮存青贮的pH值分别从5.98和5.58下降到4.40和4.80左右，添加组均显著低于对照组(P＜0.01)。不同温度中贮存青贮的乳酸含量，对照组分别为0.92 g/kg DM和0.32 g/kg DM，添加组分别为10.22 g/kg DM以上和6.02 g/kg DM以上，添加组极显著高于对照组（P＜0.01）。25℃贮存的对照组醋酸含量为0.77 g/kg DM，添加组分别为1.08、1.20 g/kg DM和0.53 g/kg DM，L.panis和L.frumenti添加组显著高于对照组和L.farciminis组(P＜0.05)。35℃贮存的对照组醋酸含量为0.82 g/kg DM，添加组分别为0.57、0.63 g/kg DM和0.71 g/kg DM，添加组和对照组无差异。在25℃贮存的对照组中表现为酒精生成量为优势的发酵特性,酒精含量达到21.44 g/kg DM，而添加组酒精含量分别为9.93、12.81 g/kg DM和7.27 g/kg DM，添加组极显著低于对照组（P＜0.01）。在35℃贮存的对照组酒精含量为3.23 g/kg DM，添加组酒精含量分别为1.35、2.22 g/kg DM和3.88 g/kg DM，添加组和对照组无差异。25℃贮存的对照组中2,3-丁二醇含量为4.46 g/kg DM，添加组分别为1.64、2.39 g/kg DM和1.15 g/kg DM，L.panis和L.far⁃ciminis添加组显著低于对照组（P＜0.05）；35 ℃贮存的对照组中2,3-丁二醇含量为0.37 g/kg DM，添加组分别为0.15 g/kg DM、0.14 g/kg DM和0.23 g/kg DM，添加组和对照组无差异。不同温度下，添加组可以极显著降低乳酸菌含量，25℃贮存青贮乳酸菌数分别为108、106、106cfu/g和107cfu/g，L.panis和L.frumenti添加组极显著低于对照组（P＜0.01）。35℃贮存青贮乳酸菌数分别为107、106、106cfu/g和106cfu/g，添加组极显著低于对照组（P＜0.01）。25℃贮存青贮，相对于对照组104cfu/g的酵母菌数量，添加L.panis和L.farciminis的青贮中酵母菌数都在102cfu/g以下，而添加L.frumenti的青贮酵母菌数在103cfu/g以下。35℃贮存对照组和添加组大肠菌数都在102cfu/g以下。

表2 贮存2个月后青贮中发酵产物和活菌情况

青贮开封后有氧变败试验结果如下：开封后放置于空气中后，不论在25℃贮存还是35℃贮存，对照组和添加组的pH值都有上升，但是25℃贮存的L.panis青贮组的3个平行中有2个样品的pH值未升高，也未出现L.frumenti以及L.farciminis添加组的发酵生成物消失的现象。添加组青贮的发热时间都比对照组青贮延迟1 d，即使是发热了，温度升高程度也低于对照组。

有氧变败试验结果表明，25℃贮存青贮，pH值分别为7.46、5.43、6.99和6.25，均高于开封时pH值，但是L.panis组有低于其他组的趋势；35℃贮存青贮有氧变败试验后，pH值分别为6.72、5.91、6.13和7.31，均高于开封时pH值，但是L.farciminis组有高于其他组的趋势。25℃贮存乳酸含量分别为1.41、18.22、10.61 g/kg DM和17.89 g/kg DM,L.panis和L.farciminis组变败后样品中乳酸含量极显著高于对照（P＜0.01）；35℃贮存青贮有氧变败后样品中乳酸含量无显著性差异。25℃贮存醋酸含量分别为4.50、1.63、3.64 g/kg DM和1.61 g/kg DM,L.panis和L.farciminis组变败后样品中醋酸含量极显著高于对照（P＜0.01）；35℃贮存青贮有氧变败后样品中醋酸含量无显著性差异。有氧变败试验后，样品中酒精含量大幅下降，而25℃贮存的L.panis组酒精含量却大幅升高；35℃贮存的L.panis组酒精含量稍有升高。25℃贮存青贮L.panis组的2,3-丁二醇含量稍有升高，其他组的都下降，35℃贮存时，2,3-丁二醇含量均升高。变败试验后，除25℃贮存青贮L.panis和L.frumenti组的乳酸菌数量比开封时略有升高外，而对照组和L.farciminis组乳酸菌数量都下降。

DGGE的结果可见(见图1)，L.panis，L.frumenti以及L.farciminis菌株出现在相同位置处（见图1），因而可以判定为添加的L.panis、L.frumenti以及L.farcimi⁃nis在青贮中还保留下了DNA。另一方面，添加组在有氧变败前后的细菌DGGE图谱几乎没有变化，因此预测L.panis、L.frumenti以及L.farciminis对于抑制变败有一定的效果。

3 讨论

图1 25℃和35℃贮存2个月的无添加(Con)和添加Lactobacillus panis(Pan)、Lactobacillus frumenti(Fru)和Lactobacillus farciminis(Far)的意大利黑麦草青贮在开封时以及在25℃有氧变败测试后青贮中微生物群态

25℃贮存青贮L.panis和L.frumenti添加组中乳酸和醋酸含量显著高于对照组和L.farciminis组，L.panis和L.frumenti是异型发酵乳酸菌[19-20]，可以把葡萄糖发酵生成乳酸和醋酸或者是乳酸和酒精[17]，L.far⁃ciminis是同型发酵乳酸菌，可以把葡萄糖发酵生成乳酸[21]，但是在添加试验结果中L.panis和L.frumenti表现为乳酸为优势的发酵，这与一般意义的异型发酵乳酸菌不太一致，原因也不能确定，需要继续研究其发酵特性。25℃贮存青贮中，对照组产生大量的酒精和2,3-丁二醇，添加L.panis和L.farciminis组的酒精和2，3-丁二醇含量显著低于对照组，可能是因为添加的L.panis和L.farciminis有抑制大肠菌、芽孢杆菌和酵母菌的能力，因为在青贮发酵过程中，葡萄糖在大肠杆菌和酵母菌作用下，产生酒精，丙酮酸在大肠杆菌的作用下生成2,3-丁二醇，Bacillus polymyxa将糖类发酵为酒精和2,3-丁二醇[22]。25℃贮存添加L.panis、L.frumenti组中乳酸菌数量极显著低于对照组，酵母菌数量也低于对照组，表明L.panis和L.frumenti对于细菌和真菌有一定的抑制作用。

35℃贮存时,添加组青贮的乳酸含量极高于对照组，而添加组之间差异不显著，添加组与对照组的醋酸含量没有差异，添加的三株菌均表现为乳酸发酵型，该结果显示高温贮存条件下与预想的在35℃贮存时添加效果比25℃的更明显的结果所相反，也许因为在较高温度贮存时L.panis、L.frumenti和L.farciminis的发酵特性受到了影响，后续需要进行生长温度对其影响的确认试验。35℃贮存青贮中，L.panis、L.frumenti添加组酒精和2,3-丁二醇含量稍低于对照组和L.farciminis组，可能是在较高温度下L.panis、L.frumenti比L.farciminis对大肠杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的有较强的抑制能力。

35℃贮存青贮中干物质含量高于25℃贮存青贮，乳酸含量、酒精含量和2,3丁二酸含量均低于25℃贮存青贮含量。作者在对不同温度贮存TMR青贮发酵品质的研究结果中发现，随着贮存温度的升高，干物质含量增加，25℃和35℃贮存90 d时，乳酸含量和醋酸有降低的趋势，酒精含量在贮存30 d和90 d时，35℃低于25℃青贮含量。Kim等的研究结果也显示：在20℃和40℃贮存的玉米青贮中，干物质含量、乳酸和醋酸含量随着贮存温度升高而出现降低的趋势[23]。这与王超[17]的研究结果一致。

L.farciminis的添加效果不是很明显,这个原因还不清楚,但是在王超前期的研究中,冬季加工的全混合青贮中检测出了L.farciminis[13]，因此认为，可能是因为25℃的贮存温度比L.farciminis的适宜生长温度偏高而未表现出添加效果。35℃贮存时，L.panis、L.frumenti和L.farciminis的添加效果均不明显，出现这个结果可能是因为细菌需要适宜的生长温度,而在35℃的贮存温度，不是细菌的适宜生长温度，因此未表现出添加效果。

L.panis、L.frumenti和L.farciminis的添加均未表现出有氧变败的抑制效果。25℃贮存时，对有氧变败有一定的效果，但是未出现像L.buchneri那样的明显的抑制效果。添加的3种“发面引子”乳酸菌中L.panis的效果还保留有一些悬念。开封时不仅酵母菌的数量减少,能够印证抑制变败的发酵产物未出现变化。L.panis抑制变败中稍微延长了变败的时间，乳酸和挥发性脂肪酸的减少也较少些，但是没有特别明显的抑制真菌的效果，随着低pH值和有机酸的增加，可能是非解离酸在发挥抗菌作用。

从以上这些的结果，我们认为能够维持发酵TMR的有氧稳定性的“发面引子”乳酸菌中单个的菌株是较难发挥作用的。由于在发酵TMR中存在多种“发面引子”乳酸菌，而我们在添加试验时只是选了几株单株菌进行添加，而未出现明显添加效果，可能是几种乳酸菌混合后的协同效应下，发挥其有氧变败的抑制作用。

4 结论

TMR青贮中存在的乳酸菌的添加可以改变意大利黑麦草青贮的发酵产物，但是不能抑制有氧变败。今后还需要进行混合菌株的添加试验，以说明TMR青贮不易发生有氧变败的原因。