酶菌联用降解羽毛工艺优化及降解产物对黑水虻幼虫生长性能的影响

■Mazu Sabirath Shanti 林俊宏 朱剑锋 朱 辉 李楚君 庞 旭 董 璐 胡文锋，，*

（1.华南农业大学，广东广州510642；2.汕头职业技术学院，广东汕头515078；3.生物源生物技术(深圳)股份有限公司，广东深圳518118；4.广州无两生物科技有限公司，广东广州510642）

全球人口持续增长，2050年将达到90亿，因而未来人类对蛋白类食物如肉、蛋、奶的需求量将越来越大。禽畜养殖业及屠宰加工行业每年都会产生大量的羽毛，而羽毛中含大量的角蛋白，因此是一个巨大的蛋白质和必需氨基酸来源[1]。角蛋白可通过物理、化学和生物学的方法进行降解而资源化利用。但物理和化学降解可能破坏某些氨基酸，并产生其他非营养氨基酸[2]，因此利用微生物和酶等生物学方法降解角蛋白是未来废弃羽毛利用的一大趋势。

黑水虻（学名：亮斑扁角水虻，Hermetia illucens L.），其幼虫是一种食用昆虫，可以为动物及人类提供优质的蛋白。黑水虻具有繁殖速度快、生长周期短、管理方便、营养丰富、动物适口性好等特点，在替代动物饲料蛋白原料方面具有广阔前景，正在世界范围内推广[3-4]。相关研究表明，角蛋白的空间结构十分牢固，因此黑水虻幼虫不能直接消化利用羽毛。为此，本试验以鸡羽毛为底物，以从蛇胃肠道筛选得到蜡样芽孢杆菌YSQ08为发酵菌种，配合角蛋白酶，对羽毛进行降解处理，优化生产工艺条件，提高角蛋白的降解效率。之后将羽毛发酵产物制成黑水虻幼虫饲料，研究羽毛发酵物对黑水虻幼虫生长性能的影响。试验旨在为废弃羽毛的高效资源化处理和利用开发新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

1.1.1 试验材料

鸡毛由广东某生鸡屠宰公司提供，经洗涤剂漂洗、自来水清洗后烘干粉碎，备用；蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereusYSQ08）分离自蛇消化道内容物，由华南农业大学食品学院应用微生物实验室提供；角蛋白酶购自济南诺能生物工程有限公司，酶活20 000 U/g；新鲜干净猪粪由广州良种猪场提供。黑水虻幼虫由广州无两生物科技有限公司提供，按常规程序进行养殖。

1.1.2 试验试剂

菌种分离培养基（液体）：0.50 g氯化钠（NaCl）、0.06 g无水氯化钙（CaCl2）、0.10 g氯化镁（MgCl2）、1.40 g磷酸氢二钾（K2HPO4）、0.70 g磷酸二氢钾（KH2PO4）。用0.1 M NaOH溶液将pH值调至7.0，蒸馏水定容至1 000 ml，按每瓶100 ml加2.0 g羽毛分装于250 ml锥形瓶中，121℃灭菌30 min，备用。若加入2.0%琼脂粉，则为分离菌种用的固体培养基。

蜡样芽孢杆菌YSQ08种子培养基：10 g胰蛋白胨（Tryptone）、5 g酵母提取物（Yeast Extract）、10 g氯化钠（NaCl），蒸馏水定容至1 000 ml；用0.1 M NaOH溶液将pH值调至7.0；按每瓶100 ml分装于250 ml锥形瓶中，121℃灭菌30 min，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 蜡样芽孢杆菌YSQ08的活化与纯化

菌种活化：从-80℃冰箱取出蜡样芽孢杆菌YSQ08，在LB平板上画线，37℃培养24 h。挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养24 h，重复一次，即得到初步活化的蜡样芽孢杆菌YSQ08单菌落培养液。革兰氏染色，观察颜色以及细胞形态，应为紫色的革兰氏阳性菌。如有杂菌，重复上述步骤多次，达到活化与纯化的目的。

再次挑取单菌落接种于带羽毛的液体分离培养基试管中，37℃、200 r/min振荡培养48 h。试管发酵完毕后，取2.0 ml发酵液转接于100 ml带羽毛液体分离培养基中，37℃、200 r/min振荡培养48 h。接种环沾取上述发酵液在LB平板上画线，37℃培养14 h；再挑取单菌落转接于LB液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养14 h，得到能大量分泌角蛋白酶的蜡样芽孢杆菌YSQ08纯种。

1.2.2 生长曲线的测定

将经活化与纯化得到的蜡样芽孢杆菌YSQ08进行批次液体培养，测定生长曲线。蜡样芽孢杆菌YSQ08按1%接种量接入液体培养基中，装液量为50 ml/250 ml，于37℃、150 r/min摇床培养。采用比浊法，每2 h测定蜡样芽孢杆菌YSQ08培养液十倍稀释液的OD600值，绘制生长曲线。

1.2.3 不同pH值对羽毛降解的影响

按1%(v/v)接种量制备蜡样芽孢杆菌YSQ08种子，按每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（发酵1 d后添加）、羽毛添加量2.0%(w/v)、接种量2.0%(v/v)，37 ℃、200 r/min发酵3 d。用0.1 M NaOH溶液将发酵液初始pH值分别调到7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。发酵结束测定羽毛降解率。

1.2.4 不同角蛋白酶添加量对羽毛降解的影响

按1%(v/v)接种量制备蜡样芽孢杆菌YSQ08种子液，在pH值9.0、羽毛添加量2.0%(w/v)、接种量2.0%(v/v)的条件下，37℃、200 r/min发酵3 d；设置发酵1 d后每克羽毛添加角蛋白酶量分别为500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U。发酵结束测定羽毛降解率。

1.2.5 不同细菌接种量对羽毛降解的影响

按1%(v/v)接种量制备蜡样芽孢杆菌YSQ08种子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（发酵1 d后添加）、羽毛添加量2.0%(w/v)的条件下，37℃、200 r/min发酵3 d，接种量(v/v)分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。发酵结束测定羽毛降解率。

1.2.6 不同羽毛添加量对羽毛降解的影响

按1%(v/v)接种量制备蜡样芽孢杆菌YSQ08种子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（发酵1 d后添加）、接种量3.0%(v/v)的条件下，37℃、200 r/min发酵3 d，羽毛添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%(w/v)。发酵结束测定羽毛降解率。

1.2.7 在不同发酵时间的羽毛降解率

按1%(v/v)接种量制备蜡样芽孢杆菌YSQ08种子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（发酵1 d后添加）、羽毛添加量2.5%(w/v)、接种量3.0%(v/v)的条件下，37℃、200 r/min进行发酵，分别在发酵1、2、3、4、5、6、7 d检测羽毛降解率。

1.2.8 羽毛降解产物及猪粪的常规检测

使用优化得到的工艺条件进行发酵，发酵结束后分别收集处理，得到发酵液干物质、上清液干物质和沉淀干物质，将收集得到的猪粪放入烘箱烘干，检测各降解产物和猪粪的粗蛋白质含量、水分含量和粗灰分含量。

1.2.9 黑水虻养殖效果评价

设立3个试验组，分别为发酵液干物质、上清液干物质、沉淀干物质和1个猪粪对照组，每个组设3个平行试验，每个平行试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，放入长12 cm、宽8 cm、高10 cm的幼虫培养盒。将3种羽毛发酵降解后的干物质和猪粪分别作为试验饲料，分批加入到对应的幼虫培养盒中，记录每次的投料量，当出现一半预蛹时停止加料，计算幼虫的平均增重、料重比和存活率。

1.3 指标测定方法

1.3.1 羽毛降解率

将降解产物倒入铺有快速滤纸的布氏漏斗中进行抽滤，并用蒸馏水将锥形瓶内残渣洗到滤纸上，重复2～3次。将滤纸和滤渣放入105℃烘箱烘干至恒重后，放入干燥器内，待恢复至室温称量重量。

式中：m0——滤纸质量(g)；

m1——处理前鸡毛质量(g)；

m2——滤纸和残渣总重(g)。

1.3.2 黑水虻平均增重

记录每个平行试验开始时，50头4日龄黑水虻幼虫总重m0，试验结束时将幼虫用8目筛筛出，记录存活黑水虻幼虫总重m1和数量n。

1.3.3 黑水虻料重比

记录每个平行试验开始时，50头4日龄黑水虻幼虫总重m0，试验结束时将幼虫用8目筛筛出，记录黑水虻幼虫（含死虫）总重m2和总耗料量m3。

1.3.4 黑水虻存活率

试验结束时将幼虫用8目筛筛出，记录幼虫的存活数n。

2 结果与讨论

2.1 菌种生长曲线（见图1）

生长曲线反映了菌株生长繁殖的特性，通过研究菌株的生长曲线能有效区分不同培养时间菌株所处的生长阶段。经过培养处于对数生长期后期的种子液，活菌数较大，且菌体活性较高，有利于缩短发酵时的延滞期从而提高生产效率[5]。由图1可见，培养4 h后蜡样芽孢杆菌YSQ08进入对数生长期，18 h到达对数生长期末期，培养20 h后进入稳定生长期，培养36 h后进入衰亡期。综合考虑，确定蜡样芽孢杆菌YSQ08种子液的培养时间为16 h。

图1 蜡样芽孢杆菌YSQ08生长曲线

2.2 不同pH值对羽毛降解的影响（见图2）

图2 不同发酵液pH值羽毛降解率的变化

由图2可见，在发酵液pH值为7.0～9.0时，随着pH值的升高，羽毛降解率快速上升；在发酵液pH值为9.0时，羽毛降解率达到最高为80.92%；在发酵液pH值为9～12时，随着pH值的升高，羽毛降解率逐渐下降。这是因为中强碱的环境不利于蜡样芽孢杆菌YSQ08生长，导致降解率开始下降。因此，选择发酵液pH值9.0，羽毛降解率最高。

2.3 不同角蛋白酶添加量对羽毛降解的影响(见图3)

由图3可见，随着角蛋白酶添加量的提高，羽毛降解率呈先升高后降低的趋势。在角蛋白酶添加量为500 U时，羽毛降解率为65.81%。当提高角蛋白酶添加量时，羽毛降解率逐渐上升，在添加量为2 000 U时，羽毛降解率达到峰值为77.74%。进一步提高角蛋白酶添加量，羽毛降解率缓慢下降，在添加量为4 000 U时，羽毛降解率为66.22%。因此，选择每克羽毛角蛋白酶添加量为2 000 U，羽毛降解率最高。

图3 不同角蛋白酶添加量羽毛降解率的变化

2.4 不同细菌接种量对羽毛降解的影响（见图4）

图4 不同细菌接种量羽毛降解率的变化

由图4可见，随着接种量的提高，羽毛降解率呈缓慢上升的趋势，在接种量为3%时，羽毛降解率达到最大为75.13%。接种量的大小对菌体生长速度有巨大的影响。当接种量过小时，菌体生长速度较慢，发酵周期延长且易染菌；但接种量过大则菌体生长过快，造成营养物质缺乏或溶氧不足，从而影响酶的合成[6]。因此，选择3%作为羽毛降解菌种接种量。

2.5 不同羽毛添加量对羽毛降解的影响（见图5）

由图5可见，随着羽毛添加量的提高，羽毛降解率先升高后降低。在羽毛添加量为2.5%时，羽毛降解率达到最大值为74.53%。相关研究表明，多数角蛋白酶是诱导型蛋白酶，一般随着底物添加浓度的升高，酶活有相同的变化趋势[7-8]。因此，本试验中羽毛添加量为0.5%～2.5%时，羽毛降解率随着羽毛添加量的提高而升高。当进一步提高羽毛添加量时，羽毛降解率开始快速下降。这可能是因为羽毛添加量过高降低了培养环境的溶氧量，抑制了蜡样芽孢杆菌的生长，降低了蜡样芽孢杆菌降解羽毛的生产效率[9]。因此，选择羽毛添加量为2.5%，羽毛降解率最高。

图5 不同羽毛添加量羽毛降解率的变化

2.6 在不同发酵时间的羽毛降解率（见图6）

图6 不同发酵时间的羽毛降解率的变化

由图6可见，随着发酵时间的延长，羽毛降解率呈先快速升高后趋于稳定的趋势。在发酵时间为1～5 d时，羽毛降解率上升速度较快，平均增长率为7.24%，在发酵时间为5 d时，羽毛降解率达到80.04%；在发酵时间为5～7 d时，羽毛降解率相对稳定，平均增长率仅为0.79%。不同发酵时间羽毛降解率的变化趋势体现了发酵时间对菌种生长和酶活的影响，发酵5 d后，羽毛降解率相对稳定，这可能是因为培养基中的营养物质已经消耗殆尽，再加上其他副产物的影响，菌种活性下降甚至死亡，酶分泌量下降，造成羽毛降解率上升放缓[10]。因此，选择发酵时间为5 d，羽毛降解率最高。

2.7 羽毛降解产物及猪粪常规检测（见表1）

表1 各降解产物及猪粪常规检测结果(%)

由表1可见，沉淀干物质的粗蛋白质含量最高，可达到92.36%，其次为发酵液干物质，达到87.35%，再次为上清液干物质，达到41.43%，最低为猪粪，达到16.12%；发酵液干物质、上清液干物质、沉淀干物质和猪粪的含水量分别为5.41%、6.68%、5.32%、10.17%；发酵液干物质的粗灰分最低，可达到4.33%，其次为猪粪，达到6.10%，再次为沉淀干物质，达到7.46%，最高为上清液干物质，达到22.73%。上清液干物质的粗灰分较高，这可能是因为培养基在配制的过程中添加了一定量的盐类，而这些盐类溶解于上清液，从而导致上清液干物质粗灰分较高；另一方面，上清液中的含氮物质多为小分子的氨基酸和肽，而大分子的多肽和蛋白质仍存在于沉淀物中，从而导致上清液干物质的粗蛋白质含量较发酵液干物质和沉淀干物质低。

2.8 黑水虻平均增重（见图7）

图7 不同饲料对黑水虻平均增重的影响

由图7可见，使用上清液干物质作为饲料，黑水虻平均增重最高，为0.239 9 g/头，其次为猪粪，为0.217 9 g/头。使用发酵液干物质和沉淀干物质作为饲料，黑水虻平均增重均低于猪粪组。结合表1可知，上清液干物质和猪粪的粗蛋白质含量均低于发酵液干物质和沉淀干物质，但黑水虻平均增重试验结果均优于其他两组。这可能是因为，发酵液干物质和沉淀干物质中含大量消化率较低的蛋白质，如角蛋白等。使用发酵液干物质和沉淀干物质作为饲料，仍有相当一部分蛋白质不能得到有效利用。

2.9 黑水虻料重比（见图8）

图8 不同饲料对黑水虻料重比的影响

由图8可知，使用上清液干物质作为饲料，可使黑水虻料重比达到最优为2.63。使用发酵液干物质、沉淀干物质和猪粪作为饲料，黑水虻料重比均高于上清液干物质组，分别为5.33、5.88、6.19。这可能是因为，上清液干物质中含有各种黑水虻能高效利用的营养物质，如小肽、氨基酸等，且含量较高，从而料重比较低；而猪粪粗蛋白含量较低仅为16.12%，黑水虻为摄取足够营养必须大量采食，造成料重比偏高的情况。

2.10 黑水虻存活率（见图9）

图9 不同饲料对黑水虻存活率的影响

由图9可见，上清液干物质组黑水虻存活率最高，达到90.79%；其次为发酵液干物质组，达到87.10%。沉淀干物质组黑水虻存活率为84.89%，猪粪组黑水虻存活率最低为83.51%。这可能是因为，猪粪能产生氨气、硫化氢等有毒气体，还含有各种致病菌和虫卵[11]，这些因素都可能对黑水虻的生长、健康产生负面影响。

3 结论

本文以羽毛降解率为指标，从pH值、酶添加量、接种量、羽毛添加量和发酵时间共5个因素对角蛋白酶和蜡样芽孢杆菌联用降解羽毛的工艺进行优化，确定适宜的生产条件为：pH值9.0、酶添加量2 000 U/g、接种量3.0%(v/v)、羽毛添加量2.5%、发酵时间为5 d。使用发酵上清液干物质作为饲料养殖黑水虻幼虫，能有效提高黑水虻幼虫平均增重，优化料重比，提高存活率。通过酶菌联合处理羽毛，之后再饲喂黑水虻可能为羽毛等废弃物资源化的新途径。