制取小麦旗叶粗酶液的最佳缓冲体系研究

高 玲

(青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109)

制取小麦旗叶粗酶液的最佳缓冲体系研究

高 玲

(青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109)

[目的]探讨制取小麦旗叶粗酶液的最佳缓冲体系。[方法]采用不同的缓冲体系制备小麦旗叶粗酶液，测定小麦旗叶中过氧化物酶(POD)、淀粉酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)的活力。 [结果] 当pH为6.2时，POD活力最高；当pH为5.8时，淀粉酶活力最高；当pH为7.0时，PAL和LOX活力最高。选用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取缓冲液时，PAL和LOX活力最高。当此缓冲液浓度为0.15 mol/L时，POD活力最高；当此缓冲液浓度为0.10 mol/L时，淀粉酶和LOX活力最高；当此缓冲液浓度为0.05 mol/L时，PAL活力最高。 [结论]制取粗酶液的最佳缓冲体系是pH 7.0、0.10 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

小麦；旗叶；粗酶液；缓冲体系

小麦籽粒产量主要依赖于小麦开花后光合物质的积累[1-2]，而旗叶是小麦生育后期重要的光合器官，其功能期的长短与小麦的单穗重和千粒重的关系极为密切。目前，国内外对籽粒干物质积累的作用已有大量报道。大量研究表明，小麦旗叶中保护酶含量的高低能在一定程度上反映叶片的衰老进程[3-4]，因此研究不同条件对旗叶中保护酶活性的影响可为生产中如何延长旗叶功能期，进而增加小麦产量提供理论依据[5-7]。但是，不同种酶采用提取液的类型、浓度、pH等存在差异[8-15]。笔者以小麦旗叶为试验材料，探讨制取小麦旗叶粗酶液的最佳缓冲体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料 选用5月初大田种植的LN-3小麦旗叶为试验材料。

1.2 试验方法 先将采集的小麦旗叶叶片洗净擦干，称取0.2 g，加入适量缓冲液及少量石英砂，研磨成匀浆，转入离心管，10 000 r/min转速下离心10 min。记录上清液体积，放入冰浴中备用。过氧化物酶(POD)活力的测定参照王学奎[16]的方法；淀粉酶(Amylase)活力的测定采用DNS法[17]；脂氧合酶(LOX)活力的测定参照钟芳等[18]的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定参照邵伏文等[19]的方法。

2 结果与分析

2.1 不同pH对小麦旗叶中酶活力的影响 用不同pH的缓冲液提取小麦旗叶中的混合酶，然后进行相应酶活力的测定。从图1、2可以看出，POD和淀粉酶活力在pH 6.0时最高，PAL和LOX活力在pH 7.0时最高。当pH为7.0时，POD和淀粉酶活力分别为pH 6.0时酶活的92%和80%，因此在后续试验中选取pH 7.0的缓冲液。

图1 不同pH对小麦旗叶中POD和淀粉酶活力的影响Fig.1 The effects of different pH on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

图2 不同pH对小麦旗叶中PAL和LOX活力的影响Fig.2 The effects of different pH on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.2 不同缓冲液类型对小麦旗叶中酶活力的影响 在确定不同酶活力最高的pH大致范围后，为分析不同缓冲液类型对小麦旗叶中酶活力的影响，试验选用3种pH相同但组分不同的常用缓冲体系对酶活力进行测定。从图3、4可以看出，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液最适合这4种酶，此条件下PAL和LOX活力最高，POD活力达到最高活力的74.5%，淀粉酶活力达到最高活力的78.0%。

图3 不同缓冲液类型对小麦旗叶中POD和淀粉酶活力的影响Fig.3 The effects of different types of buffer on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

图4 不同缓冲液类型对小麦旗叶中PAL和LOX活力的影响Fig.4 The effects of different types of buffer on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.3 不同浓度的缓冲液对小麦旗叶中酶活力的影响 为了探讨缓冲液的浓度变化对酶活力的影响，试验选用对4种酶均适合的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行。从图5、6可以看出，当缓冲液浓度为0.15 mol/L时，POD活力最高；当缓冲液浓度为0.10 mol/L时，淀粉酶和LOX活力最高；当缓冲液浓度为0.05 mol/L时，PAL活力最高。

图5 不同缓冲液浓度对小麦旗叶中POD和淀粉酶活力的影响Fig.5 The effects of buffer concentration on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

图6 不同缓冲液浓度对小麦旗叶中PAL和LOX活力的影响Fig.6 The effects of buffer concentration on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.4 pH的微调对小麦旗叶中酶活力的影响 为了探讨缓冲液pH的细微变化对酶活力的影响，选择对4种酶均适合的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行试验。从图7、8可以看出，当pH为5.8时，小麦旗叶中淀粉酶活力最高；当pH为6.2时，POD活力最高；当pH为7.0时，PAL和LOX活力最高。

图7 pH的微调对小麦旗叶中POD和淀粉酶活力的影响Fig.7 The effects of fine adjustment of pH on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

图8 pH的微调对小麦旗叶中PAL和LOX活力的影响Fig.8 The effects of fine adjustment of pH on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

3 讨论与结论

酶的结构特点及催化特性决定了不同的酶在活力最高时所需的条件不同，因此提取酶所用的缓冲体系的类型、pH、溶液离子浓度的高低等是必须考虑的因素。小麦籽粒产量的高低与旗叶的功能期长短直接相关，因此旗叶中各种酶的活力成为检测旗叶功能的重要指标。在测定各种酶活力时应根据不同的酶选择不同的缓冲体系进行提取与测定，增加了工作量和难度。笔者采用不同的缓冲体系对小麦旗叶中POD、淀粉酶、PAL、LOX这4种酶活力进行了测定。结果表明，当pH为6.2时，POD活力最高；当pH为5.8时，淀粉酶活力最高；当pH为7.0时，PAL和LOX活力最高。磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液最适合这4种酶，此条件下PAL和LOX活力最高，POD活力达到最高活力的74.5%，淀粉酶活力达到最高活力的78.0%。

当缓冲液浓度为0.15 mol/L时，POD活力最高；当缓冲液浓度为0.10 mol/L时，淀粉酶与LOX活力最高；当缓冲液浓度为0.05 mol/L时，PAL活力最高。 综上所述，提取小麦旗叶中混合酶的粗酶液的最佳缓冲体系为pH 7.0、0.10 mol/L 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。参考文献

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Study on the Optimum Buffering System for Preparing Crude Enzymes in Flag Leaves of Wheat

GAO Ling

(College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109)

[Objective] To study the optimum buffering system for preparing crude enzymes in flag leaves of wheat. [Method] Taking flag leaves of wheat as test materials, different buffering systems were used to prepare crude enzymes in flag leaves of wheat. And the activities of POD, amylase, PAL, LOX in flag leaves of wheat were determined. [Result] When pH was 6.2, POD activity was the highest; When pH was 5.8, amylase activity was the highest; When pH was 7.0, both PAL activity and LOX activity reached the maximum values. When Na2HPO4-NaH2PO4buffer was used as the extracting buffer in the test, PAL and LOX activities both reached the maximum values. When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.15 mol/L, POD activity was the highest; When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.10 mol/L, amylase activity and LOX activity reached the maximum values; When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.05 mol/L, PAL activity was the highest. [Conclusion] The optimum buffering system for preparing crude enzymes in flag leaves of wheat was Na2HPO4-NaH2PO4buffer(pH 7.0, 0.10 mol/L).

Wheat; Flag leaves; Crude enzymes; Buffering system

青岛市民生科技计划项目(14-2-3-43-nsh)。

高玲(1967- )，女，山东潍坊人，副教授，博士，硕士生导师，从事酶学和蛋白质研究。

2016-11-11

S 512.1；Q 55

A

0517-6611(2016)35-0017-03