超大孔聚合物亲和色谱层析介质的制备及评价

张荣月，陈暄友，张 祎，姜成伟，黄逸康，李 强，丁 虹，潘一廷，刘 才

(1.北京石油化工学院 化学工程学院，北京 102617；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)



超大孔聚合物亲和色谱层析介质的制备及评价

张荣月1*，陈暄友1，张 祎1，姜成伟1，黄逸康1，李 强2，丁 虹1，潘一廷1，刘 才1

(1.北京石油化工学院 化学工程学院，北京 102617；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)

探索了用席夫碱法在超大孔聚合物微球表面偶联Protein A配基制备亲和层析介质的方法，以亲水化后的聚丙烯酸酯类超大孔微球为基质，考察了氧化剂浓度(H5IO6)对配基偶联量的影响，以扫描电子显微镜表征微球表面形貌，结果发现其偶联Protein A后微球仍能够保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(361～3 600 cm/h)下的动态载量，在3 600 cm/h操作流速下，人抗体载量与361 cm/h相比仅下降10%左右，表明该类介质适合抗体大分子的快速传质，能够满足快速、高效、高通量分离纯化的需求。

亲和层析；偶联方法；Protein A配基；超大孔层析介质；抗体纯化

亲和层析是利用生物活性物质之间的特异亲和力，使目标产物得以分离纯化的液相层析方法，可应用于任何两种有特异性相互作用的生物大分子[1]。由于抗体与抗原作用具有高度的专一性，且该亲和力极强，亲和层析技术兼具高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点，因而被广泛应用于生物大分子的分离纯化[2-4]。以Protein A为亲和配基是目前应用最为广泛的亲和介质[5-8]，其在抗体纯化实际生产中，一步纯化即可得到高达95%纯度。

介质的基质(固相载体)及其结构对介质的性能(机械强度、比表面积、传质性能等)具有重要影响。抗体亲和介质的基质主要有天然多糖类(琼脂糖、葡聚糖等)、高分子聚合物(聚苯乙烯、聚丙烯酸等)和无机材料类(多孔玻璃和硅胶)[9-13]。其中琼脂糖微球具有良好的生物相容性和易于衍生功能基团的优点，而交联技术的引入，部分克服了琼脂糖微球机械强度低和孔径小的不足，可将其耐压指标提高到0.3 MPa的水平(如Mab Select Sure亲和介质)，大大拓宽了其应用领域[11]，但其耐压性能仍难以同时满足高流速和大规模化层析的要求。此外，随着操作流速的增加，孔径在30～50 nm左右的多孔琼脂糖微球介质的动态载量急剧下降[14]，无法实现抗体的高通量制备。近年来，周炜清等采用“反胶团溶胀法”制备了超大孔聚合微球[15]，并对其表面采用葡聚糖进行亲水化修饰[16]。该类微球具有百纳米级的贯通孔，适用于生物大分子的快速传质，同时能够耐受10 MPa操作压力，从而为快速、高通量的分离纯化提供了一条解决途径。

本文基于亲水化后的超大孔聚合物微球为基质，通过席夫碱法在其表面偶联Protein A配基制备亲和层析介质，从而实现了快速、高效分离纯化抗体的目的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

蛋白质纯化系统AKTA(美国通用公司，Purifier 10)配有紫外及电导检测器，紫外-可见分光光度计，扫描电子显微镜(FEI Quanta400F，美国FEI公司)。供偶联亲和配基用的超大孔聚合物微球为实验室自制(称为Gigaporous-OH)，环氧氯丙烷、高碘酸、NaOH、氰基硼氢化钠、硫酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，Protein A(美国Sigma-Aldrich公司)。色谱用超纯水为实验室自制。

1.2 实验方法

1.2.1 超大孔Protein A亲和层析介质的制备 偶联配基实验如图1所示，共分为4步：①连接环氧基：量取10 mL自制超大孔PGMA-EDMA微球置于三角瓶中，并向其中加入2 mol/L NaOH水溶液50 mL，将盛有上述溶液的三角瓶放入摇床中振荡10 min，然后加入10 mL环氧氯丙烷室温下继续振荡5 h，反应完毕后，抽滤并用水洗涤至中性；②水解环氧基为二羟基：将微球转移至50 mL 浓度为0.5 mol/L H2SO4水溶液中，升温至50 ℃振荡过夜反应，水解反应完毕后，抽滤并用去离子水洗涤至中性；③氧化二羟基为醛基：将微球转移至50 mL 5%浓度的H5IO6乙酸溶液中，室温下振荡12 h，反应完毕后，抽滤并用水洗涤至中性；④将微球转移至50 mL的10 mg/mL Protein A 磷酸缓冲液(pH 6.0)，同时加入氰基硼氢化钠室温下振荡24 h，反应完毕后，将反应液离心处理，取上清液测定其在280 nm下的吸收值，计算微球偶联配基量。

图1 Protein A亲和层析介质的制备过程示意图Fig.1 The process for preparation of Protein A affinity supports

1.2.2 介质性能评价 介质静态载量与动态载量的测定，测试样品为5 mg/mL Ig G。①静态载量测定：在盛有8.0 mL上述蛋白溶液的10 mL离心管中加入1.0 mL自制亲和介质，室温下垂直混合过夜，离心取上清液用紫外分光光度计测其在280 nm下吸收值，根据标准工作曲线计算介质的静态载量；②动态载量测定：将自制介质装填于4.6 mm×50 mm色谱柱中，用5 个柱体积(CV) 20 mmol/L pH 7.0 磷酸缓冲液平衡色谱柱后，将测试蛋白溶液用液相色谱泵头直接上样，当穿透曲线高度达到10%时停止进样，用洗脱流动相(pH 3.0，0.1 mol/L甘氨酸/盐酸溶液)进行洗脱。按上述操作分别考察361，1 800，3 600 cm/h流速下的载量，记录10%穿透体积，计算动态载量值(Q10%):Q10%=C0V10%/V，其中C0为Ig G样品浓度，V10%为10%流穿体积，V为介质体积。

2 结果与讨论

2.1 高碘酸浓度对亲和配基偶联量的影响

高碘酸浓度高低意味着氧化能力的强弱，其浓度越高则氧化能力越强。表1数据表明，高碘酸浓度在3%～7%范围内随着H5IO6浓度的增加，微球表面醛基量呈先上升后下降的趋势，当H5IO6浓度为5%时，醛基达到最大量为0.11 mmol/mL，其可能原因是随着H5IO6(氧化剂)浓度的增加，氧化反应速率增快，故所得醛基量增加，但随着浓度的进一步增加，过强的氧化能力将使醛基发生进一步的氧化反应，因此当H5IO6浓度高于5%时，醛基含量出现下降。而Protein A配基偶联量与醛基量则呈正比关系，主要是醛基提供偶联位点，故其增加，配基偶联量也随之变化。同时，考察了不同配基偶联量下介质的静态载量(表1)，结果显示，Ig G的静态载量随着配基偶联的增加而升高，在最大配基偶联量26 mg/mL时，其静态载量达到最高值(31 mg/mL)。为了获得较高的分离效率，选择5%为最佳H5IO6使用浓度，以该条件下制备的亲和介质(Gigaporous-Protein A)作为后续的研究对象。

表1 不同H5IO6浓度下所得介质的配基偶联量及抗体载量

图2 偶联亲和配基前(A1，A2)后(B1，B2)的微球表面形貌图Fig.2 Morphology of microspheres before(A1，A2) and after(B1，B2) coupling Protein A

2.2 介质表面形貌及通透性的考察

图2为Gigaporous-OH偶联亲和配基前后的扫描电子显微镜对比图，其中图2A1和A2分别为偶联前的Gigaporous-OH的表面形貌，可以看出微球表面有百纳米级的大孔；图2B1和B2为偶联Protein A配基后的微球表面形貌图，可以看出百纳米级的超大孔依然存在，表明偶联配基未阻塞微球的大孔结构，这为该亲和介质保持良好的通透性奠定了基础。为进一步表征该亲和介质的传质性能，考察了介质在不同操作流速下的柱背压，结果显示，在流速1～8 mL/min范围内，偶联前后的微球柱压均随操作流速的增加而呈线性增长，这表明微球有较好的机械强度，能在测试压力范围内保持原有的刚性结构未发生形变。同时对比偶联配基前后两种微球的变化曲线，可以发现偶联配基后的微球在相同操作流速下柱压均有所升高，表明Protein A大分子配基增加了介质的传质阻力。

图3 不同流速下对人血清中抗体的纯化色谱图(A)和纯化后的Ig G凝胶电泳图(B)Fig.3 Purification of Ig G from human serum on GigaporousProtein A at different flow rates(A) and the corresponding purify of Ig G by gel electrophoresis(B)

2.3 亲和介质动态载量及色谱性能评价

考察了不同操作流速(361～3600 cm/h)下，自制Gigaporous-Protein A的动态载量。结果显示，随着操作流速的升高，其数值稍有下降，如3 600 cm/h流速下的载量(24±0.2 mg/mL)相比低流速361 cm/h的载量(28±0.2 mg/mL)下降了14%，即流速升高10倍的情况下，载量仅下降10%左右，表明该类介质对抗体大分子有着良好的传质特性。而同类型的琼脂糖基质的亲和介质在流速升高10倍时，其载量下降通常大于50%[14]。为进一步印证这一特性，考察了该介质在不同流速下对人血清中抗体的纯化效率，图3为Gigaporous-Protein A在不同流速下的人血清纯化谱图(A)以及纯化后的Ig G的凝胶电泳图(B)。从凝胶电泳图上看出，在高流速3 600 cm/h纯化得到的Ig G纯度与低流速下无明显差别。综合该亲和介质的以上表现，可以看出Gigaporous-Protein A适合快速、高通量的抗体分离纯化。

由于亲和配基的稳定性也是亲和层析介质的又一重要参数，本实验还考察了上样-洗脱-再生50次循环后，在3 600 cm/h操作流速下，其Ig G动态载量。得到Ig G动态载量值为(23±0.3) mg/mL，表明亲和配基Protein A在使用过程中能保持较好的活性与稳定性。

3 结 论

本文以Protein A为亲和配基，通过席夫碱法将其偶联至超大孔聚丙烯酸微球表面制备亲和层析介质。在氧化剂高碘酸的考察浓度范围(3%～7%)内，亲和配基的偶联量随其浓度的增加出现先上升后下降的变化规律，在5% H5IO6浓度下，可获得最高偶联量为(26±0.1) mg/mL。该亲和介质对抗体(人Ig G)的载量与亲和配基的偶联量呈正比关系。该自制Gigaporous-Protein A介质的Ig G动态载量在高流速下(考察流速范围361～3 600 cm/h)无明显变化，同时在高流速下从人血清中可得到高纯度抗体，表明该介质在高通量分离纯化抗体方面有较好的应用前景。

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Preparation and Characterization of Gigaporous Polymer Affinity Chromatographic Supports

ZHANG Rong-yue1*，CHEN Xuan-you1，ZHANG Yi1，JIANG Cheng-wei1，HUANG Yi-kang1，LI Qiang2，DING Hong1，PAN Yi-ting1，LIU Cai1

(1.Department of Chemical Engineering，Beijing Institute of Petro-chemical Technology，Beijing 102617，China；2.National Key Lab of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China)

A method was explored for the preparation of affinity chromatographic support， based on the hydrophilic gigaporous polymer microspheres using Protein A as affinity ligands.The effect of H5IO6on amount of Protein A was evaluated.The morphology of the microspheres was observed by scanning electronic microscopy.The result showed that the throughput pores were maintained in the affinity media.At different flow rates(361-3 600 cm/h)，the dynamic capacity of human Ig G on the affinity supports were determined,and the result indicated the capacity at 3 600 cm/h decreased about 10% in comparison with that at 361 cm/h.The above results indicated that this affinity support could meet the requirement for rapid and high-throughput separation of proteins.

affinity chromatography; coupling method;Protein A ligand; gigaporous chromatographic support; purification of antibody

2016-05-03；

2016-06-29

北京市自然科学基金(2162013)；国家自然科学基金(51103158)；北京石油化工学院优秀人才培育计划项目(080318620081/037)；北京高等学校高水平人才交叉培养“实培计划”项目(201507,201506)；2016大学生URT项目(16032082001/009)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.023

O657.7；S852.43

A

1004-4957(2016)12-1643-04

*通讯作者：张荣月，博士，副教授，研究方向：聚合物层析介质的制备及在生化分离纯化中的应用研究，Tel:010-81292132，E-mail:ryzhang@iccas.ac.cn