气相色谱-质谱法测定食品中黄樟素及其衍生物含量

祝伟霞，李 睢，张 丽，胡 锴，杨冀州，张淑霞

(1.河南出入境检验检疫局，河南 郑州 450003；2.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450000)



气相色谱-质谱法测定食品中黄樟素及其衍生物含量

祝伟霞1*，李 睢2，张 丽1，胡 锴2，杨冀州1，张淑霞1

(1.河南出入境检验检疫局，河南 郑州 450003；2.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450000)

建立了调味制品(调味料、番茄酱、酱油、花椒)、饮料(碳酸饮料、乳饮料、果汁)、肉制品(香肠、肉罐头、肉汤)、水果制品(果冻、果酱)、水产品(干鱼肉、鱼罐头、鱼肉泥)、小吃类(油炸薯片、糖果、巧克力)等18种食品中黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素含量的分析方法。样品在氯化钠盐析作用下，经二氯甲烷-乙腈提取，无水硫酸钠-氟罗里硅土柱吸附极性物质和水分。复杂样品需再经PRiME HLB固相萃取柱(SPE)净化，5%苯基-95%甲基聚硅氧烷毛细管气相色谱柱分离，选择离子质谱技术监测，内标法定量。在最佳实验条件下，3种黄樟素在25～5 000 μg/kg范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)≥0.998 1，方法检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为20 μg/kg和50 μg/kg，3个加标水平的回收率为77.6%～100.9%，相对标准偏差(RSD)为3.7%～13.6%。多种实际样品的测定结果表明，该方法准确可靠，适用于食品中3种黄樟素及其衍生物的定量和定性分析。

气相色谱-质谱(GC-MS)；选择离子扫描(SIM)；固相萃取(SPE)；黄樟素；香料添加剂；食品

黄樟素(SFL)广泛存在于黄樟、沉水樟和坚叶樟等天然芳香植物提取物中，是黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分，可作为天然香精用于食品、化妆品和烟草制品生产[1]。异黄樟素(DSFL)和二氢黄樟素(ISFL)是黄樟素的衍生物，也可作为香料添加剂用于食品加工[2]。研究表明，黄樟素对人体具有一定的毒副作用，易诱发基因突变和肝损伤，是消化系统、血液系统、泌尿系统的强致癌物[3-4]。因此，美国食品法规(§189.180)规定不得将黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素作为添加剂加入食品中[5]，欧盟法规(EC/1334/2008)禁止将黄樟素作为香料和食品添加剂用于食品生产。为了控制天然植物或精油中污染黄樟素，欧盟还规定了天然食品中黄樟素的最高残留水平，其中肉及肉制品为15 mg/kg，水产品及其制品为15 mg/kg，调味料及调味酱为25 mg/kg，不含酒精的饮料为1 mg/kg[6]。我国《化妆品卫生规范》(2015)禁止添加黄樟素。为保障我国食品安全，建立一种食品中黄樟素、异黄樟素和二氢黄樟素的分析方法是非常必要的。

目前，有关黄樟素检测的研究主要涉及香精香料[7-9]、化妆品[10]、烟草制品[2,11]、天然产物[1,12]，分别采用气相色谱氢火焰离子化法(GC-FID)[13-14]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9-11]、液相色谱荧光法(HPLC-FLD)[8]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[7]等技术。2003年，Siano等[15]首次研究了GC-FID测定食品中黄樟素、甲基胡椒酚和甲基丁香酚的分析方法，目前尚无有关食品中黄樟素、二氢黄樟素、异黄樟素测定的报道。本方法以弥补食品中黄樟素及其衍生物检测方法空白为目标，建立了固相萃取/气相色谱-质谱技术测定18种食品中黄樟素及其衍生物的确证分析方法，可为食品质量安全和风险评估提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC-MS QP2010plus气相色谱-质谱仪(配电子轰击源，日本Shimadzu公司)；氟罗里硅土柱(6 mL/1 g，北京振翔工贸有限公司)；OASIS PRiME HLB柱(6 mL/200 mg，美国Waters公司)；5210型超声波清洗器(美国Bransonic公司)；SA-31振荡器(日本大和科学株式会社)；24位固相萃取装置(德国CNW Technologies公司)；CF15RXII离心机(日本Hitachi公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；0.2 μm有机相滤膜(天津津腾公司)；二氢黄樟素(纯度≥95%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)，黄樟素和异黄樟素纯度均≥95%，购于加拿大TRC研究院；内标物质：3-间甲苯乙酸酯(纯度99%，上海TCI化成工业公司)；甲醇、二氯甲烷、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；氯化钠；无水硫酸钠在650 ℃灼烧4 h，于干燥器中储存备用。

1.2 溶液的配制

标准储备溶液：分别称取50 mg(精确至0.1 mg)标准物质，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为1.0 g/L的单个标准储备液。该溶液于-18 ℃密封储存，有效期6个月。内标储备溶液：准确称取10 mg(精确至0.1 mg)内标，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度为100.0 mg/L的标准储备液，该溶液于-18 ℃密封储存，有效期6个月。混合标准溶液：分别量取1 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度为10.0 mg/L的混合标准溶液，于2～4 ℃密封储存，有效期6个月。二氯甲烷-乙腈溶液(体积比1∶1)：分别量取500 mL二氯甲烷和500 mL乙腈混合均匀后备用。

1.3 样品前处理

1.3.1 饮料和水果制品 准确称取2.5 g均匀试样(精确至0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入50 μL内标溶液(10.0 mg/L)、1.0 g氯化钠和15 mL二氯甲烷-乙腈溶液，涡旋混匀3 min，超声提取15 min，于4 000 r/min转速下离心5 min，转移上清液于另一离心管中。再加入15 mL二氯甲烷-乙腈溶液重复涡旋、超声与离心步骤，合并两次上清液，待净化。

称取1.0 g无水硫酸钠装载至Florisil柱中，转移样液至Florisil柱，待样液完全通过后，加入5 mL乙腈淋洗，收集全部流出液于常温下氮吹至20 mL左右，并用乙腈定容至25 mL。取1 mL样液经0.22 μm滤膜过滤后，进行GC-MS测定。

1.3.2 调味制品、肉制品、水产品和小吃类食品 萃取步骤同上，合并两次上清液，待净化。

称取1.0 g无水硫酸钠装载至Florisil柱中，转移样液至Florisil柱，待样液流完全通过后，加入5 mL乙腈淋洗，收集全部流出液于常温下氮吹至20 mL左右，并用乙腈定容至25 mL。吸取5 mL样液过PRiME HLB 固相萃取柱，控制流速小于1.0 mL/min，弃去前段约0.5 mL流出液，收集1 mL流出液经0.22 μm滤膜过滤后，进行GC-MS测定。

1.4 GC-MS 条件

色谱柱：TR-5MS 5%苯基-95%甲基聚硅氧烷色谱柱，30 m×0.25 mm(i.d),0.25 μm；载气：氦气，纯度≥99.999%；流速：恒流模式 1.0 mL/min；色谱柱升温程序：初始温度90 ℃保持1 min，以2.5 ℃/min升至 140 ℃，再以30 ℃/min升至250 ℃保持5 min。进样口温度：260 ℃；GC-MS接口温度：250 ℃；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样；离子源：电子轰击源(EI)；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟时间：7.0 min；检测方式：选择离子监测(SIM)；内标物监测离子：m/z108(定量离子)，150，107，79；黄樟素和异樟素监测离子：m/z162(定量离子)，131，104,77；二氢黄樟素监测离子：m/z164(定量离子)，135，77，105。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

测定黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素的提取溶剂主要采用二氯甲烷和甲醇[7,10,13,15]。本方法对比了二氯甲烷和甲醇提取18种食品的效果。结果显示，采用二氯甲烷提取含有乳蛋白基质的样品时，易产生乳化现象，采用加热、增加氯化钠量、高速离心等方法均未能解决乳化问题；二氯甲烷提取巧克力、油脂等脂溶性样品时，样品全部溶解。进行GC-MS测定时，分析物的保留时间产生漂移，不利于定性和定量分析；而采用甲醇提取含水量高的食品时，需增加除水步骤，不利于气相色谱测定。

实验进一步考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-乙腈、正己烷作为提取溶剂时的提取效率。结果表明，以上溶剂对食品中黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素的提取效率均不低于90%，但采用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷提取含乳蛋白或高含量淀粉的样品时，易产生乳化现象，不利于实验操作的进行。结合净化方法的优化结果，本方法最终选用二氯甲烷-乙腈(1∶1)作为提取溶剂。

2.2 提取方式的选择

以黄樟素阳性的调料粉、阴性样品添加回收为实验对象，考察了超声、振荡加热、涡旋混合、超声+涡旋振荡等常用提取方法的效果。结果显示，由于黄樟素类化合物具有挥发性，其在加热条件下的回收率偏低；而采用超声+涡旋振荡时的回收率最高，因此本方法采用超声+涡旋振荡的方法进行提取。

2.3 净化方法的选择

本方法的18种基质可归为高水分、高蛋白、高脂类、高糖类样品，二氯甲烷-乙腈提取液未净化直接测定时干扰物多。因此对净化方法进行了研究，并考察了以下几种净化方法的回收率：液液萃取法(LLE)(饱和氯化钠水溶液中二氯甲烷液液分配NaCl LLE、硅藻土液液萃取DmE LLE)；正相SPE法(Florisil柱、硅胶柱Si、氨基柱NH2、Cleanert柱、中性氧化铝柱Alumina-N)；QuERChERS法；反相SPE法(HLB柱、PRiME HLB柱)。

实验结果表明：LLE法仅限于测定液态和水溶性固态样品，对于脂溶性固态样品无法操作；采用硅胶固相萃取柱、氨基柱、Cleanert 柱、中性氧化铝柱净化食品中黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素时，3种分析物均未能定量保留和洗脱；QuERChERS法净化后进行GC-MS测定，黄樟素和二氢黄樟素出峰处有干扰；样液过Florisil柱过程中，极性干扰物被吸附，3种待测物全部流出，回收率最高，因此本方法采用Florisil柱去除干扰物。反相SPE法测定3种分析物的回收率均不小于53.2%，其中新型PRiME HLB柱的回收率最高。PRiME HLB柱可去除基质中蛋白、盐、磷脂等干扰物，并以乙腈载体溶剂中效果最佳，因此对于复杂的食品样品，本方法增加PRiME HLB进行净化(图1列出不同净化方法对比结果)。

2.4 样品浓缩方法的优化

比较了100 μg/L混合标准溶液未氮吹、氮吹过半、常温氮吹至干、50 ℃氮吹至干的响应强度。结果发现内标物和3种分析物在未氮吹、氮吹过半中的响应强度未发生变化，氮吹至干后响应强度降低18.2%～31.5%，加热氮吹至干后响应强度降低46.1%～63.0%，证明4种化合物在加热或氮吹至干条件下易挥发，不利于准确定量。同时在采用PRiME HLB柱净化过程中，溶液中二氯甲烷影响脂类物质的去除，因此本法采用常温下氮吹去除样液中二氯甲烷溶剂。

图1 不同净化方法的回收率比较Fig.1 Comparison on recoveries of different purification method

2.5 方法的线性关系、检出限、回收率及精密度

图2 标准溶液的总离子流色谱图(50 μg/L)Fig.2 Total ion chromatogram of standard solution(50 μg/L)

采用乙腈配制2.5，5.0，10，25，50，100，500 μg/L的标准溶液，添加内标浓度为50 μg/L，以待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(Y)，待测物与内标的浓度比为横坐标(X)，绘制标准曲线，获得线性方程：黄樟素Y=1.602×10-2X+1.671×10-3(r2=0.999 5)，二氢黄樟素Y=8.694×10-3X+1.859×10-3(r2=0.998 1)，异樟素Y=1.145×10-2X+1.893×10-3(r2=0.999 0)。由于采用本方法测定时，分析物被稀释10倍，因此方法的线性范围为25～5 000 μg/kg。标准溶液的SIM图见图2。将信噪比(S/N)≥3定义为LOD，S/N≥10定义为LOQ，得本方法的LOD为20 μg/kg，LOQ为50 μg/kg。

以不含黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素的调味制品(调味料、酱油、番茄酱、花椒)、饮料类(碳酸饮料、乳饮料、果汁)、肉制品(香肠、肉罐头、肉汤)、水果制品(果冻、果酱)、水产品(干鱼肉、肉泥、鱼罐头)、小吃类(薯片、糖果、巧克力)为实验样品，分别添加50，100，1 000 μg/kg 3个浓度水平进行回收实验，每个浓度平行测定6次，测得平均回收率为77.6%～100.9%，相对标准偏差(RSD)为3.7%～13.6%。表1列出了部分调味制品中黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素的回收率和RSD。

表1 方法的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

(续表1)

SampleAdded(μg/kg)SafroleIsosafroleDihydrosafroleRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Chocolate508611078817686794100918104913419626810009021108458493363

图3 方便面样品中黄樟素(370 μg/kg)的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of safrole in positive snack noodle(370 μg/kg)

2.6 实际样品的测定

黄樟素属天然香料，在许多天然植物中广泛存在。采用本方法对市场上购买的姜、洋葱、葱、蒜、肉蔻、八角、桂皮、茴香、荆芥、石香、香菜、芹菜、调味料、方便面等46个样品进行黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素的含量测定。结果表明，除葱、洋葱、石香、芹菜未检出黄樟素外，其它样品均检出黄樟素，其中蒜芥、蒜、香菜含有少量黄樟素(<50 μg/kg)，姜、桂皮和方便面中检出黄樟素含量为228.1～731 μg/kg，茴香、肉蔻、八角和调味品中黄樟素含量为7.2～1 503.2 mg/kg。所有样品均未检出异黄樟素和二氢黄樟素。图3为方便面中检出黄樟素的总离子流图。

3 结 论

本文建立了气相色谱-质谱技术测定食品中黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素含量的分析方法。通过优化最佳的提取条件，联用无水硫酸钠、氟罗里硅土和PRiME HLB固相萃取的净化方法，全扫描和选择离子同时监测用于定量检测和定性确证，验证了18种不同的食品基质。方法参数均满足《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，为食品中黄樟素及其衍生物的风险评估提供了可靠的技术基础。

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Determination of Safrole and its Derivatives in Foodstuffs by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHU Wei-xia1*,LI Sui2,ZHANG Li1,HU Kai2,YANG Ji-zhou1,ZHANG Shu-xia1

(1.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhengzhou 450003,China;2.College of Pharmacy,Henan University of Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,China)

An analytical method was developed for the determination of safrole(SFL),isosafrole(DSFL) and dihydrosafrole(ISFL) in 18 foods including condiment,tomato,sauce,soy sauce,pepper,carbonated beverage,milk drink,juice,sausage,canned meat,meat soup,jelly,jam,dried fish,canned fish,fish slime,potato chip,candy and chocolate by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).The sample was extracted with dichloromethane-acetonitrile in the presence of sodium chloride salt-out.Water and polar substances were removed with anhydrous sodium sulfite-florisil column.For complex matrices,further purification was performed with a PRiME HLB solid-phase extraction columns.The separation was carried out on a 5%phenyl-95% methyl polysiloxane capillary GC column.The detection of compounds was completed in the selected ion monitoring mode(SIM).The quantification analysis was performed by the internal standard method.Good linear relationships(r2≥0.998 1) betweeen peak areas ratios and concentrations ratios of 3 analytes were obtained in the range of 25-5 000 μg/kg.The limits of detection(LOD) for 3 analytes were 20 μg/kg.And the limits of quantitation(LOQ) were 50 μg/kg.The average recoveries of the method varied from 77.6% to 100.9% at 3 different spiked levels,with relative standard deviations(RSD) of 3.7%-13.6%.By measuring real samples,the results showed that this method was accurate and reliable for quantification and confirmation of SFL,DSFL and ISFL in foodstuffs.

gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);selected ion monitor(SIM);solid-phase extraction(SPE);safrole;spice additives;foodstuffs

2016-06-27；

2016-08-18

出入境检验检疫行业标准制定项目(2012B137)；国家质检总局科技计划项目(2015IK115)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.014

O657.63；Q946.85

A

1004-4957(2016)12-1596-05

*通讯作者：祝伟霞，硕士，高级工程师，研究方向：食品安全检测，Tel:0371-55196533,E-mail:wxzhu121@163.com