178例肝细胞癌患者DNA甲基转移酶3A基因rs1550117位点多态性检测及意义

徐峰，叶青，王静，杨永红

(1天津市第三中心医院分院，天津300250；2天津市第三中心医院；3天津中医药大学第一附属医院)

178例肝细胞癌患者DNA甲基转移酶3A基因rs1550117位点多态性检测及意义

徐峰1，叶青2，王静3，杨永红1

(1天津市第三中心医院分院，天津300250；2天津市第三中心医院；3天津中医药大学第一附属医院)

目的 探讨DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)基因rs1550117位点多态性与肝细胞癌发生的关系。方法 采用Sequenom MassArray质谱阵列技术，检测天津汉族人群178例肝细胞癌患者(观察组)及188例健康人(对照组)DNMT3A基因rs1550117位点多态性。结果 观察组DNMT3A基因rs1550117位点基因型AA、AG、GG频率分别为4.5%、36.0%、59.5%，等位基因G、A频率分别为81.3%、18.7%；对照组基因型AA、AG、GG频率分别为3.2%、29.4%、67.4%，等位基因G、A频率分别为83.8%、16.2%；两组比较P均>0.05。结论 DNMT3A基因rs1550117位点多态性与肝细胞癌的发生无明显关系。

肝细胞癌；DNA甲基转移酶3A；基因位点多态性

肝细胞癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其发生涉及多基因调控、多信号通路，根源是多基因的异常表达[1～3]。单核苷酸多态性(SNP)是导致及反映个体肿瘤遗传易感差异的重要原因之一[4]。原癌基因激活及抑癌基因失活是肝细胞癌发生的分子基础[5]。抑癌基因启动子区CpG岛的重新甲基化可能是抑癌基因失活的机制之一[6]，其过程由DNA甲基转移酶(DNMT)家族催化。DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)基因是DNMT家族重要成员之一，位于人染色体2p23。研究发现，DNMT3A基因rs1550117位点多态性参与胃癌、结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生、发展，但其与肝癌的关系报道较少。本研究分析178例肝细胞癌患者DNMT3A基因rs1550117位点多态性，探讨其与肝细胞癌发生的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月～2015年12月在天津市第三中心医院、天津市第三中心医院分院和天津市中医药大学第一附属医院确诊的肝细胞癌患者178例(观察组)，男92例、女86例，年龄(53.7±12.3)岁；肝功能Child-Push分级:A级28例，B级89例，C级61例；AFP>500 ng/mL 40例，200～500 ng/mL 72例，<200 ng/mL 66例；弥漫型41例，结节性89例，小肝癌48例；包膜完整52例，有血管浸润77例，合并门脉癌栓33例。TNM分期：T1～4期分别为19、36、79、44例；N 0、1期分别为127、51例；M0、1期分别为136、42例。患者均根据临床表现及影像学检查、肝穿刺活检、手术切除组织病理检查结果确诊，且临床资料完整。选取同期体检健康者188例为对照组，男98例、女90例，年龄(54.6±13.2)岁。两组性别、年龄具有可比性。两组均系天津市汉族人群，个体间均无血缘关系。调查和取样均征得患者同意，并经过天津市第三中心医院分院医学伦理委员会批准。

1.2 DNMT3A基因rs1550117位点多态性检测 ① DNA提取：观察组入院时(均未行放化疗或其他抗肿瘤药物治疗)、对照组体检时均采集外周静脉血3～4 mL，采用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取外周血白细胞基因组DNA，步骤参照试剂盒说明书。采用紫外分光光度计进行DNA浓度测定，标化浓度>25 ng/μL，纯度OD260/OD280≥1.7，OD260/OD230≥1，样本量>20 μL。提取好的DNA保存于-80 ℃冰箱备用。②引物的设计与合成：采用Sequenom MassArray Design3.1软件设计DNMT3A基因rs1550117位点的PCR引物，其中特异性扩增引物1 st序列为5′-ACGTTGGATGCACCTCTGTCTAATTCCACC-3′，扩增引物2 nd序列为5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′；延伸引物序列为5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′。根据引物浓度计算加入双蒸水的量，稀释单管扩增引物浓度至100 μmol/L，加入双蒸水混合使各引物浓度为0.5 μmol/L；稀释单管延伸引物浓度至500 μmol/L，加入双蒸水混合使各引物浓度为8 μmol/L。③基因分型：利用Sequenom MassArray质谱阵列技术对DNMT3A基因rs1550117位点进行基因分型。具体方法：a. PCR扩增：5.0 μL PCR反应体系：1.0 μL DNA样本、1.8 μL水、5.0 μL PCR缓冲液、0.1 μL dNTP、0.4 μL MgCl2、1.0 μL PCR引物及0.2 μL酶；PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45个循环，最终72 ℃延伸3 min。b. 碱性磷酸酶反应及单碱基延伸：2.0 μL SAP混合液由1.53 μL水、0.17 μL SAP缓冲液、0.3 μL SAP酶构成。SAP反应条件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。碱性磷酸酶处理后针对SNP进行单碱基延伸：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸60 s，共40个循环；最终72 ℃延伸3 min。c.测序：将分型产物用树脂脱盐后经自动点样仪点样于384孔板PCR仪(384-element Spectro CHIP)上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，最终结果由MassArray RT软件系统进行实时读取，分析基因分型。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。采用Hardy-Weinberg平衡软件进行遗传平衡检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组等位基因和基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，均具有群体代表性。两组DNMT3A基因rs1550117位点基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 两组DNMT3A基因rs1550117位点基因型和等位基因分布[例(%)]

3 讨论

SNP是在基因组水平上由单个核苷酸变异(置换、颠换、缺失和插入)引起的一种DNA序列多态性，已经被作为第3代遗传标志[7]。Sequenom MassArray质谱阵列技术其基本原理为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术，具有高通量的检测系统，可以高效自动化筛查SNP，适合大规模筛查的需要。

DNMT3A是DNA甲基转移酶家族中重要的从头甲基化酶，其通过调节细胞内甲基化过程而参与肿瘤的发生、发展。DNMT3A基因rs1550117位点位于CpG启动子区，该位点基因突变与肿瘤的相关性研究国内外已有报道，尤其是与胃癌的关系报道较多，但结论差异较大。Fan等[8]发现，在中国江苏汉族人群中，DNMT3A启动子区rs1550117位点多态性与胃癌的发生、发展有明显的相关性，其潜在机制可能和G>A变异型的高度活跃有关，提示DNMT3A多态性可以作为胃癌基因易感性的指标。Wang等[9]对吉林胃癌人群的研究发现，DNMT3A基因rs1550117位点AG或AA基因型患者比GG基因型患者具有更短的生存期及更高的死亡风险，提示rs1550117基因多态性与胃癌患者预后相关，其可能是预测胃癌患者总生存期的潜在生物标记物。Cao等[10]研究发现，DNMT3A基因rs1550117位点AA基因型人群幽门螺杆菌感染风险较GG、AG基因型人群明显增加，但未发现其基因多态性和萎缩性胃炎及胃癌有明显相关性。Yang等[11]在针对广州人群的研究未发现DNMT3A基因rs1550117位点多态性与胃癌相关。上述结果提示，DNMT3A基因rs1550117位点多态性与胃癌的关系可能存在地域的差异性，且DNMT3A活性改变和rs1550117位点错义突变之间的潜在关联尚待明确。

另外，研究者们还对DNMT3A基因多态性与卵巢癌、乳腺癌、结肠癌等的关系进行研究，结论差异亦较大。例如，波兰人群DNMT3A基因包括rs1550117在内的5个位点多态性和卵巢癌的发病、发展无明显相关性[12]，但rs1550117多态性位点可能是避免机体患系统性红斑狼疮的原因之一[13]；Szczepańska等[14]研究未发现DNMT3A 基因rs1550117等5个位点多态性与子宫内膜异位症及子宫内膜异位症相关的不孕症有关；Sun等[15]研究未发现DNMT3A基因rs1550117等6个位点多态性与乳腺癌有相关性；Zhao等[16]报道，DNMT3A基因rs1550117位点多态性和结直肠癌的基因易感性有关，其可能作为预测结直肠癌发病的分层指标，尤其适用于50岁以上的男性个体；Ling等[17]研究发现，DNMT3A基因rs1550117位点AA基因型个体罹患迟发性阿尔茨海默病的风险是GG基因型的2.08倍，是GG+GA基因型的2.05倍，表明DNMT3A基因多态性在迟发性阿尔茨海默病的发病中发挥一定作用，可以作为预测个体对迟发性阿尔茨海默病易感性的分层标记物。上述研究结果提示，DNMT3A基因rs1550117位点多态性与不同疾病发生、发展的关系不同，可能与种族的遗传背景、饮食结构及环境暴露等因素不同有关。

目前，国内外关于DNMT3A基因rs1550117位点多态性与肝细胞癌的关系报道较少。本研究两组DNMT3A基因rs1550117位点的基因型及等位基因分布频率的差异均无统计学意义，提示肝细胞癌的发生与DNMT3A基因rs1550117位点多态性无明显相关性。但本研究样本量较小，且受试对象来源地域单一，结果有待增加样本量、扩大研究地域，多中心、分层研究明确。

综上所述，DNMT3A基因rs1550117位点多态性与肝癌的发生无明显关系。

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杨永红(E-mail: 754156284@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.026

R735.7

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1002-266X(2016)44-0072-03

2016-03-24)