血清miR-6801在非小细胞肺癌辅助诊断中的临床意义

时广利，班武娟，陈 燕，尹颜军，白万秋，丁湘彧

(首都医科大学附属北京胸科医院，北京 101149)



·论 著·

血清miR-6801在非小细胞肺癌辅助诊断中的临床意义

时广利，班武娟，陈 燕，尹颜军，白万秋，丁湘彧△

(首都医科大学附属北京胸科医院，北京 101149)

目的 探讨血清miR-6801在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达水平及其在NSCLC辅助诊断中的临床意义。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测40例健康人和78例NSCLC患者血清中miR-6801的表达量,并构建受试者操作特征(ROC)曲线计算血清miR-6801的灵敏度和特异度。结果 NSCLC患者血清中miR-6801的表达水平显著低于健康者，差异有统计学意义(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表达水平显著低于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05)；血清miR-6801对NSCLC检测的灵敏度为51.9%；miR-6801对Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC检测的灵敏度为40.6%。结论 NSCLC患者miR-6801的检测对于NSCLC的辅助诊断和早期诊断有一定的临床应用价值。

非小细胞肺癌； 微小RNA； 辅助诊断； 聚合酶链反应

肺癌是严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤之一，其病死率居各种恶性肿瘤之首。75%～80%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC)，其5年存活率仅为15%～20%，而Ⅰa期发现并治疗的患者，5年生存率可达80%[1]。缺乏有效的NSCLC早期诊断手段是NSCLC患者高病死率的主要原因[2]。微小RNA(miRNA)是一类内源性高度保守的长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，miRNA在肿瘤的发生、发展中有致癌和抑癌的不同作用[3]。miRNA在血清中非常稳定，有可能作为诊断肺癌的新血清标志物[4]。因此，本研究对NSCLC患者与健康者血清中miR-6801的表达水平进行了检测，探讨血清miR-6801表达水平在NSCLC辅助诊断中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年8月至2015年10月首都医科大学附属北京胸科医院收治的初治NSCLC患者78例(NSCLC组)，其中男45例、女33例，年龄41～73岁(平均50.1岁)，其中肺腺癌38例、肺鳞癌40例。所有NSCLC患者全部经细胞学或组织学确诊，既往未进行放疗或化疗，肺癌分期参照2002年美国癌症联合协会(AJCC)标准。健康对照组为北京胸科医院体检健康职工40例，其中男19例、女21例，年龄25～55岁(平均39.4岁)，无高血压、高血脂、糖尿病等基础性疾病。

1.2 标本采集 用真空采血管收集NSCLC患者和健康人空腹外周静脉血4 mL。所有标本经4 000 r/min离心后分离出血清，收集后的血清标本放至-80 ℃超低温冰箱中冷冻，集中进行miRNA的提取。此研究经本院伦理委员会审核通过。

1.3 方法

1.3.1 血清标本miRNA的提取 按照北京天根生化科技有限公司生产的miRNA提取试剂盒的操作说明书提取所有血清标本中的miRNA，使用Quawell Q3000微量核酸检测仪对提取的miRNA进行检测。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) qRT-PCR实验以合成的cDNA为模板，同时以miR-103作为内参照。qRT-PCR反应为20 μL体系，PCR反应循环条件：94 ℃预热2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共进行45个循环。qRT-PCR实验数据经过Lightcycler 480Ⅱ软件进行分析，每个cDNA标本的表达量检测均重复3次，血清miRNA的相对表达量用2-ΔCt表示。

1.3.3 血清标本癌胚抗原(CEA)的检测 所有血清标本CEA的浓度测定釆用流式荧光免疫法，CEA检测试剂盒由上海透景生物科技有限公司生产，应用美国LUMINEX200流式荧光点阵分析仪进行测定。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以中位数(四分位间距)表示。多组间血清miRNA相对表达量比较采用Kruskal WallisH检验，两组之间比较采用Mann-WhitneyU检验；通过受试者操作特征曲线(ROC)分析miRNA表达水平对NSCLC诊断价值，并计算95%置信区间；组间率的比较采用χ2检验。所有统计学检验均为双侧概率检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清miR-6801相对表达量的检测结果 NSCLC组患者血清中miR-6801的表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义(Z=2.128,P<0.05)；NSCLC组患者血清中miR-6801的表达水平与患者性别及吸烟状态不相关，差异无统计学意义(P>0.05)。NSCLC组经TNM分期后，血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表达水平显著低于Ⅰ期+Ⅱ期(Z=2.081,P<0.05)；NSCLC组经病理分期后，血清miR-6801在腺癌中的表达水平与鳞癌比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组研究对象血清中miR-6801的相对表达量

注：与健康对照组比较，*P=0.029；与Ⅰ期+Ⅱ期比较，#P=0.041。

2.2 血清miR-6801对NSCLC检测的灵敏度 血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中检测的灵敏度(57.8%)显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(χ2=5.565,P<0.05)；血清miR-6801对早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)检测的灵敏度(40.6%)显著高于CEA(21.9%)，差异有统计学意义(χ2=4.875,P<0.05)；血清miR-6801在肺腺癌中检测的灵敏度与肺鳞癌比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 血清miR-6801对NSCLC检测的灵敏度(%)

注：与CEA比较，*P=0.024；与Ⅰ期+Ⅱ期比较，#P=0.038。

2.3 血清miR-6801在NSCLC中的诊断价值分析 应用ROC曲线分析血清miR-6801在NSCLC中的诊断价值，血清miR-6801诊断NSCLC的ROC曲线下面积(AUC)为0.732,95%置信区间(CI)=0.628～0.831；血清miR-6801对NSCLC的诊断价值高于血清CEA(AUC=0.596，95%CI=0.484～0.709)。

3 讨 论

目前，CT、X线片等影像学检查及支气管镜和痰脱落细胞检查是最常用的肺癌检测手段。但是，胸片和痰脱落细胞检查在肺癌诊断中的灵敏度比较低。支气管镜检查为侵入性方式检查。而CT检查由对肺癌诊断的灵敏度过高而容易引起假阳性。尽管有人建议低剂量螺旋CT可作为肺癌筛查的常规手段，但仍处于研究阶段[5]。肿瘤标志物对肺癌的辅助诊断、早期诊断、预后判断和疗效监测具有重要的应用价值。但是，目前应用的肿瘤标志物在肺癌诊断中的灵敏度较低，尤其是在早期肺癌(Ⅰ期+Ⅱ期)中的灵敏度更低，对于肺癌的诊断具有很大的局限性[6]。因此，寻找新型、并且特异度和灵敏度都比较好的血液肿瘤标志物是当今临床迫切需要的。

miRNA在细胞的增殖、凋亡、肿瘤的发生、发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用，miRNA有可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物[7]。目前，血清中miRNA作为恶性肿瘤分子标志的研究是近几年来的研究热点。血清miRNA的来源，认为主要来自于坏死或凋亡的细胞，或者来自于肿瘤细胞释放的内源性miRNA入血[4]。miRNA在血清中能够非常稳定地存在，能够抵抗RNA内切酶的降解[8]。Shen等[9]研究显示，联合检测血浆miR-21、miR-126、miR-210和miR-486-5p这4种miRNA对NSCLC检测的灵敏度和特异度高达86.2%和96.5%；对Ⅰ期NSCLC检测的灵敏度和特异度为73.3%和96.5%。Zheng等[10]研究发现，血浆miR-155、miR-197及miR-182在Ⅰ期肺癌患者中的表达水平显著上升，这3种miRNA对肺癌检测的灵敏度和特异度为81.3%和86.7%。Roth等[11]研究发现，miR-10b、miR-34a、miR-141在肺癌患者血清的表达水平明显高于良性疾病组和对照组，并与淋巴结是否转移相关联。Zhu等[12]研究结果显示，肺癌患者血清中miR-183家族(包括miR-96、miR-182和miR-183)的表达水平显著高于健康对照组，并且与肺癌患者的生存期密切相关。目前的这些研究提示，血清中miRNA表达水平与肺癌的发生、发展和病理过程密切相关，并且miRNA有可能参与肺癌的早期形成阶段。

本研究的实验结果首次发现，NSCLC患者血清中miR-6801的表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表达水平显著低于Ⅰ期+Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中检测的灵敏度(57.8%)显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(P<0.05)；血清miR-6801对早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)检测的灵敏度(40.6%)显著高于CEA(21.9%)，差异有统计学意义(P<0.05)。以上研究结果表明，血清miR-6801作为筛查NSCLC的肿瘤标志物具有潜在的临床应用价值，并且有可能成为NSCLC早期诊断的参考指标。

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Clinical significance of serum miR-6801 in auxiliary diagnosis of non-small cell lung cancer

SHIGuangli,BANWujuan,CHENYan,YINYanjun,BAIWanqiu,DINGXiangyu△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

Objective To investigate the expression level of serum miR-6801 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and its clinical significance in the auxiliary diagnosis of NSCLC.Methods The real-time quantitative PCR method was adopted to examine the expression amount of serum miR-6801 in 78 NSCLC patients and 40 healthy controls.The sensitivity and specificity of miR-6801 in the diagnosis of NSCLC were evaluated by receiver operating characteristic (ROC) curve.Results The expression level of miR-6801 in the patients with NSCLC was significantly lower than that in healthy controls with statistical difference (P<0.05);the expression level of miR-6801 at stages Ⅲ and Ⅳ was significantly lower than that at stages Ⅰ and Ⅱ (P<0.05);the sensitivity of miR-6801 in detecting NSCLC was 51.9%，and the sensitivities of miR-6801 in the stage I and II of NSCLC was 40.6 %．Conclusion The serum miR-6801 detection has a certain clinical application value for auxiliary diagnosing and early diagnosing of NSCLC.

non-small cell lung cancer； miRNA； auxiliary diagnosis； polymerase chain reaction

时广利，男，主任技师，主要从事分子生物学研究。△

，E-mail:dingxymail@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.012

A

1673-4130(2016)24-3416-03

2016-09-01

2016-10-20)