基于病人自体肿瘤细胞体外培养模型的个体化精准用药

朱路，勾越阳，鄢晓君，周律，廖泉，王斌，叶春祥，冯长江，杜亚楠

1.清华大学 医学院 生物医学工程系，北京 100084；2.军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161；3.北京协和医院 外科，北京 100032；4.北京大学人民医院 a.骨关节科；b.胃肠外科；c.胸外科，北京 100044

基于病人自体肿瘤细胞体外培养模型的个体化精准用药

朱路1，2，勾越阳1，鄢晓君1，周律1，廖泉3，王斌4a，叶春祥4b，冯长江4c，杜亚楠1

1.清华大学 医学院 生物医学工程系，北京 100084；2.军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161；3.北京协和医院 外科，北京 100032；4.北京大学人民医院 a.骨关节科；b.胃肠外科；c.胸外科，北京 100044

精准医疗概念的提出为肿瘤治疗开创了新的时代。利用基因测序技术精准地找到患者基因突变靶标，采取针对性的化疗药物治疗，对癌细胞完成“精确打击”成为肿瘤治疗的新模式。然而，由于癌细胞基因的不稳定性，仅仅采用基因测序这种间接方式，在大多数情况下并不足以给出最合理的用药方案。而精准医疗不仅仅是基因测序，还包括了多层面医疗技术的使用。利用病人自体肿瘤细胞体外模型对候选药物或药物组合进行精确的药理分析和药效检测，是一种更为直接、更为准确的肿瘤诊治模式。将基因筛选与体外肿瘤模型分析相结合，可以更大程度上的筛选出对病人个体有效的化疗药物，从而最终实现对患者进行个体化精准用药的目的。本文对基于病人自体肿瘤细胞体外模型指导个性化用药的发展历程、现状及未来展望进行了综述。

精准医疗；病人自体肿瘤细胞；药敏检测；三维培养

1 精准医疗的概念

1.1 精准医疗的背景

精准医疗需考虑患者个体化差异，其中一个发展趋势是利用基因组、蛋白质组学技术和医学前沿技术，通过分析大样本人群和特定疾病，精确地找到病因和靶点，并据此制定个性化精准治疗方案。精准医疗将改变现有的诊断、治疗模式，为医学发展带来一场变革[1]。目前我国正在制定“精准医疗”战略规划，这一规划有望纳入到“十三五”重大科技专项。与传统群体医疗以个人经验为主导、片面强调标准化不同，精准医疗更注重利用患者自身的分子生物学信息，制定与病人自身病理特点相匹配的个体化诊断和治疗策略。这种更为精确的个体化医疗模式在临床实践中显现出高度的确定性、预见性和可控性，特别适用于恶性肿瘤、糖尿病等重大疾病的临床诊治。通过整合各类组学技术和生物信息与大数据科学的交叉应用，精准医疗可以更有针对性的对特定患者的特定疾病进行个性化治疗。人们普遍相信这种新型医疗模式必将开创一个新的医学时代[2]。

1.2 精准医疗用于肿瘤治疗

癌症是当今危害人类健康的主要疾病。在中国，癌症发生率正处于快速上升期并已成为第一死因。癌症本质上与基因突变息息相关，而这一基因变异过程的发生和演变通常是动态的，且存在高度异质性。不同的疾病进展阶段以及不同的肿瘤细胞可能携带不同的变异信息，从而对以大规模人群为基础开发和测试药物的治疗模式造成了严峻挑战[3]。由于新一代测序技术的快速发展，人们已经能够快速、高分辨率地分析基因组，通过高通量测序方法获得肿瘤基因突变、拷贝数变异、基因移位和融合基因等海量基因变异信息；然后从海量的组学数据中解码和提炼相关变异信息，提取起决定性作用的关键数据，从而在成千上万的基因突变位点中，找到真正引发癌变的关键基因。再以大数据分析结果作为依据，制定因人因病而异的治疗方案[4]。然而，由于肿瘤的异质性，同一肿瘤患者不同癌细胞的基因突变并不一定相同，不同关键基因突变的随机组合，导致癌症治疗难度大为增加；更为严重的是癌症细胞周期检查点已破坏，各种新突变及融合基因仍在不断累积，这些新突变及融合基因可能会破坏这些靶向药物的靶点及其下游信号，从而使靶向治疗药物失效。因此，看似已抑制了关键基因，但癌症细胞又建立新的关键基因并产生旁路，导致费尽心思寻找到的药物在几个月时间内产生抗药性而失效[5]。从临床实践来看，由基因（生物标记）检测及诊断并通过统计/数学信息模型、生物大数据分析提炼的方法选择治疗方案仍处于发展阶段，在可靠性和重复性方面还具有相当大的挑战，导致目前完全依赖于这种间接性精准医疗方案在临床应用上仍有局限性。

1.3 基因组精准筛查与自体肿瘤细胞体外检测联合使用

为了弥补基因组精准筛查技术在可靠性和重复性方面的不足，人们开始尝试将病人自体肿瘤细胞的体外药敏检测技术引入到精准医疗方案中。杭渤等[5]等报道的癌症医疗中的个体化用药方案，见图1，通过在体外构造与病人肿瘤细胞相适应的生长微环境，使其在体外迅速适应并快速增殖，再根据基因组精准筛查遴选出的用药方案，直接观察抗癌药物或药物组合对病人自体癌细胞的反应，从而在临床用药前对基因组筛查确定的用药方案进行验证和扩展，为病人提供更为安全、可靠的个体化精准用药方案。特别是使用体外三维组织或类器官作为抗癌药物的筛选和验证模型已越来越多的受到人们的重视[5]。

图1 癌症医疗中的个体化用药方案[5]

2 基于自体肿瘤细胞体外培养模型的药敏测试技术介绍及分类

2.1 技术介绍

虽然自体肿瘤细胞体外培养模型千差万别，但其基本的实验思路是十分相似的。首先在手术切割或者活检过程中得到临床病人的肿瘤组织样本，然后通过物理与酶消化的方式获得所需的肿瘤细胞或微组织，在体外进行大规模培养。当其生长到足够的细胞数量时，分装到高通量的孔板中，用已有的抗癌药物库进行药物筛查，通过细胞活性和生物标志物表达的检测，确定有效的药物，并最终指导病人的用药[6]。

2.2 按肿瘤组织处理结果分类

2.2.1 单细胞

通过以酶消化为主、物理消化为辅的方式将肿瘤组织分离出单细胞悬液，在单细胞悬液中加测试药物进行培养，以观察克隆形成、MTT、MTS颜色、ATP荧光值、放射性掺入变化等不同检测终点，评价肿瘤细胞对药物的敏感性。其中最常用的方法是MTT、MTS、ATP法。该类方法一般来说具有检测方法简单、无需特殊设备、便于开展、实验时间短等特点。但成功率低、指导临床选择化疗药物/方案与临床结果符合率低、可靠性差。这是因为原代细胞分离成单细胞后，不容易培养生长，大多数情况下加或不加药物细胞均会因无法贴壁生长而凋亡。这可能是长期以来临床医生未能接受药敏指导化疗的主要原因之一。

另外，该类方法未能模拟体内微环境，不能对经肝酶代谢后产生抗癌作用的药物如环磷酰胺等进行药敏试验。尽管检测的手段不同，但原代细胞培养与扩增是该类方法的瓶颈，制约着其成功率和可靠性。同时分离后的原代细胞中不可避免地混杂有肿瘤间质细胞如成纤维细胞（通常较肿瘤细胞更易生长）等，可能对药敏试验的结果有影响。

2.2.2 微组织块

由于以上方法均须分离细胞，破坏了组织结构的完整性，影响了肿瘤细胞之间的相互联系，导致结果欠可靠。为此，Hoffman于20世纪90年代初建立组织块培养（HistocultureDrug Response Assay，HDRA）方法。该法是将肿瘤组织以组织块的形式在胶原上进行培养，然后加入化疗药物，观察组织块对化疗药物的敏感性。其特点是保持细胞间接触，维持了组织形态和功能，更加接近机体实体瘤内环境，临床效果相关性好，非常适用于临床应用。研究表明，HDRA法可有效指导临床化疗用药，提高多种肿瘤的临床疗效，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、骨肉瘤、头颈部鳞癌等。Tanahashi等报道了70例肺癌患者用HDRA法检测药敏，其中16例III期肺癌患者接受了诱导化疗，39例III期肺癌患者接受了辅助化疗，均按照两种敏感药物化疗、一种敏感药物化疗、不敏感药物化疗分成3组。结果发现对于采用诱导化疗者，3组的有效率分别为100%、50%和0%，两种敏感药物化疗组的3年存活率高于后两组。对于采用辅助化疗者，两种敏感药物化疗组具有更高的存活率（P=0.03），提示HDRA指导的化疗有助于提高临床疗效和生存时间。

中山大学符立梧、梁永钜等对此方法进行了改良，已成功建立了一种微小组织块培养-MTT终点染色-计算机图像分析体外药物敏感性试验法。该方法采用体外肿瘤组织块培养，通过分析给药前和给药后肿瘤组织的面积及颜色变化，获得多种单药或联合用药以及不同药物浓度下的肿瘤生长抑制率。目前已用此法检测肝癌、卵巢癌、胃癌、头颈部肿瘤等实体瘤数百例，取得良好的效果，其检测结果总符合率达85.7%。该法是目前较理想的肿瘤药敏试验方法，具有方法模拟体内微环境、稳定、重复性好、标本需要量少、实验耗时短（5 d）、可评价率高、结果直观可靠等优点，将被广泛应用。近年来，国内外许多学者对肿瘤患者的外周血白细胞（Peripheral Blood Leucocyte，PBL）和肿瘤细胞这两者对各种化疗药物敏感性的相关性进行了大量的研究，结果显示多种肿瘤患者的PBL与肿瘤细胞体外药敏检测具有较好的相关性，而且肿瘤患者的PBL和肿瘤细胞一样，对不同的药物敏感性不一样，都具有个体差异[7]。因此，对于在临床上对无法取到肿瘤标本进行药敏检测的患者，可考虑取外周血淋巴细胞代替，这样可提高药敏试验的临床适用性，但仍需广泛验证。药物基因组学与药敏试验相结合在指导肿瘤化疗方面也取得了明显的效果，如结肠癌患者胸苷合成酶（TS）基因多态性与5-Fu的疗效相关，研究表明TYMS*2/*2或TYMS*2/*3型的患者比TYMS*3/*3型对5-Fu的敏感性更高且毒副作用更小。Chang等[8]的最新研究发现，MDR1 SNPs与紫杉醇的药效相关：与MDR1 3435 CC基因型相比，3435 CT预示着接受单一紫杉醇治疗的晚期乳腺癌患者的总体生存率更短。表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制药吉非替尼在治疗非小细胞肺癌研究中也发现，肿瘤组织EGFR突变预示着吉非替尼治疗有效，无突变者敏感性显著降低。这些研究提示，肿瘤药敏试验与患者的遗传背景相结合应用于临床肿瘤治疗，对提高个体化治疗效果和降低毒副反应的发生具有重要意义。

2.3 按肿瘤模型培养方式分类

2.3.1 二维平面培养与三维立体培养

二维平面培养是目前体外构建肿瘤模型的常用方法，利用这种体外模型人们可以对肿瘤的生长、分化、侵袭、转移、凋亡及药物反应进行分析。二维单层细胞培养与三维生物材料培养比较，见图2[9]。作为一种过度简单化并严重脱离机体生物学系统的培养方式，二维培养体系缺乏真实肿瘤组织的三维微环境，如缺少细胞外基质的支持贴壁，生长的细胞失去了原有形态特征及生长分化的能力，缺乏三维立体构型以研究细胞与细胞、细胞与微环境之间的相互作用，尤其在研究恶性肿瘤细胞的浸润转移方面存在严重的局限性，导致其在抗肿瘤药物筛选和检测中经常造成假阳性[9]。

图2 二维单层细胞培养与三维生物材料培养比较[9]

体外细胞培养的一个重要原则就是模拟体内细胞生长的环境。相对于二维扁平化培养的细胞模型，三维立体环境下培养的细胞在骨架形态、分化水平、迁移能力以及细胞之间相互作用和信号转导机制等方面更加接近于体内真实情况。因此在这种微环境下生长的肿瘤模型其药物反应、抗药性程度以及药物渗透水平与体内较为接近，从而可更加准确地反映候选药物或药物组合的效果。已有相关文献对此进行了研究，例如乳腺癌细胞系MCF7在二维培养时以及在基于壳聚糖的三维支架时，在细胞增长数目、葡萄糖的消耗量以及代谢产物乳酸量上都表现出了明显的不同。在初始葡萄糖浓度相同的情况下，三维培养时MCF7在快速增长阶段消耗的葡萄糖要快，细胞数目较多；在环境中葡萄糖趋于耗尽时，三维培养的MCF7明显比二维培养的MCF7数量要多，在这个过程中，三维培养的MCF7所产生的代谢产物乳酸量也比二维培养所产生的乳酸量逐渐增多[10]。2.3.2 癌细胞单独培养与间质细胞共培养

肿瘤微环境除了具备三维空间结构，还包含有多种间质细胞及细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）。近年来的研究表明，肿瘤的发展恶化不仅仅与肿瘤细胞的自分泌有关，而且受周围细胞及基质的影响很大，与肿瘤细胞共同组成一个系统完备的微环境。这些细胞包括成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞等。肿瘤细胞与间质细胞以及细胞外基质的相互作用不仅可以影响肿瘤的生长和转移，同时也会显著影响肿瘤对药物的敏感性和耐受性。这种肿瘤微环境的形成增强了肿瘤对外界的抵抗力，特别是对药物治疗作用的抵抗，导致抗肿瘤药物的实际药效常常与单细胞肿瘤模型的预测结果不符。

在众多的间质细胞当中，所占比例最高的是成纤维细胞。这类细胞在一些因素的刺激下被激活，转变为肿瘤相关成纤维细胞（TAFs）。这类活化的TAFs能够诱发肿瘤形成，促进肿瘤生长，在某些类型的癌细胞中还会诱导发生上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal Transformation，EMT）。另一种起重要作用的间质细胞是巨噬细胞，这种细胞起源于外周血中的单核/巨噬细胞，在不同刺激条件下，单核细胞可以分化为促进肿瘤发展的M2型巨噬细胞。外周血中的单核/巨噬细胞被肿瘤微环境中的趋化因子和细胞因子募集到肿瘤微环境后，诱导分化成肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。这种TAMs表现出促进肿瘤转移和生长的作用，并且其浸润程度与恶性肿瘤的预后密切相关，在多种恶性肿瘤中高密度的TAMs浸润是患者生存率降低的指标之一。肿瘤微环境中的内皮细胞是肿瘤血管生成的基础，新生血管既为肿瘤生长提供营养和氧气，也是肿瘤侵袭和转移的主要途径。内皮细胞和肿瘤细胞相互作用导致两者粘附分子上调、肌动球蛋白骨架重组，以及钙粘蛋白的表达变化。内皮细胞还可以通过分泌某些血管生长因子和趋化因子诱导肿瘤细胞产生促炎因子，从而促进肿瘤的转移和侵袭、增加收缩力和重塑细胞骨架[11]。

2.3.3 体外直接培养与异种移植培养

除了直接将病人自体肿瘤细胞在体外培养并检测外，还有另一类被广泛采用的个体化药敏检测手段，即病人源性异种移植培养（Patient-derired Xenograft，PDX），它是将病人的临床肿瘤组织转移到裸鼠中建立动物模型并进行后续检测。美国西北医院强文安教授对其进行了深入研究并将这种方法用于药物开发与肿瘤治疗中。这种培养方法的优势是可以利用异种动物的相同组织环境最大限度的模拟人体实验环境（例如将卵巢癌组织接种于裸鼠卵巢膜下），再通过裸鼠体内微环境实现人源肿瘤细胞的扩大培养并用于药敏检测。虽然这种方法可以构造出极为复杂的肿瘤微环境，并且这种微环境很难在体外通过人工方式重建出来的，理论上来说实验结果应该更具代表性。然而从现有的研究结果来看，结果并非如此。细胞在体成瘤后（实验动物）的药敏结果并不等同于药物对患者有效，致使不少临床前有较好药效的药物在临床阶段被淘汰。另外这种方法技术难度较大、成本昂贵、实验周期长、缺少重要的免疫影响因素，并且很难实现高通量检测[12]。

3 领域现状及未来发展

3.1 病人自体肿瘤细胞的个体化药效分析和筛选技术

3.1.1 胶滴肿瘤药敏检测技术（CD-DST）

原代癌细胞来源少一直制约体外细胞药敏检测的推广。在此种研究背景下，人们建立了胶滴肿瘤药敏检测技术（Collagen gel Droplet Culture drug-Sensitivity Test，CDDST），一种体外肿瘤药敏检测技术，其突出特点是能够排除成纤维细胞对实验的干扰，在体外对抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评价，同时所需标本量小（3×103个细胞/孔）的特点扩大了该技术的应用范围，弥补了目前其他药敏检测技术的不足。国外临床研究表明，此技术的体外检测结果与临床疗效间存在较好的相关性。

由于人体内的肿瘤组织是由肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同组成的细胞群体，肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞生长产生重要影响。CD-DST技术是利用胶原凝胶在37 ℃时形成三维立体结构的特点，在体外模仿了体内肿瘤细胞生长的微环境，使肿瘤细胞能够在与体内环境相似的条件下生长，生长的肿瘤细胞具有与体内相似的细胞形态特点。经过7 d的培养后，经干胶、染色、扫描等程序最终对化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用程度做出客观评价。

CD-DST技术具有以下优势：① 细胞用量少，这样不仅可对小量的组织标本进行药物敏感性测定，而且可以对胸腹水等液体标本进行检测，从而可以使乳腺针吸活检标本、胸水标本、组织活检标本进行体外药敏检测，扩大了肿瘤药敏技术的检测范围；② 肿瘤细胞在胶原凝胶所形成的三维立体培养环境中，培养成功率高，细胞具有与体内细胞相似的生长形态；③ 本技术培养的细胞可以采用图像软件系统分析结果，可排除成纤维细胞对实验的干扰，可对抗癌药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用在体外做出客观评价；④ 结果测定快速（3 s/滴），可利用计算机进行结果分析，测定6种药物的时间只需1 min。

3.1.2 组织培养药敏检测技术（HDRA）

Hoffman于20世纪90年代初建立HDRA法[13]，此方法已在2.2.2章节中进行了叙述。

3.1.3 人肿瘤细胞原代裸鼠移植瘤模型法

为了模拟体内环境，人们将肿瘤组织块接种于裸鼠的皮下或肾包膜下，建立裸鼠移植瘤模型。由于裸鼠缺乏T淋巴细胞，异种移植时排斥反应不明显，进行人肿瘤移植时，可保持原有的生物学特性及对抗癌药物的敏感性，也可评估经代谢后起作用的药物敏感性，是进行肿瘤药敏试验的良好模型。1969年，Rygarrd和Povlsen等首次将人结肠癌细胞植入裸鼠皮下获得成功，之后许多研究者采用裸鼠皮下移植法研究人胃癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤对抗癌药物的敏感性，证实当给予荷瘤裸鼠有效药物时，移植物的化疗敏感性可从本质上反映肿瘤患者的化疗敏感性。Fiebig等报道了用此法指导36例实体瘤患者的化疗，结果显示裸鼠移植瘤法对抗癌药耐药性预测的准确率达97%，敏感性达92%。但该方法移植成功率低，同时操作复杂、要求无特定病原（Specifc Pathogen Free，SPF）级的动物实验室、移植瘤生长慢、实验耗时长（30～40 d）、费用昂贵等，不适合作为常规用于临床药敏试验的手段。

3.2 技术在国内外医疗体系中的发展现状

现阶段国内外已有多家医疗单位将病人自体肿瘤细胞的体外药敏分析作为常规诊疗服务项目。如日本早在2008年就由中央社会保险医疗协会发布了《对现有医疗保险引入的先进医疗技术》，将病人自体肿瘤细胞的体外抗癌药敏感性试验（主要是CD-DST方法）列入“被评定为适合优先引进医疗保险的现今医疗”。这一协会在另一份文件《根据新联合实施的先进医疗专家会议的第二项先进医疗科学评价结果》中，将CD-DST法的抗恶性肿瘤药敏实验总评结果设为“适用”。适应症包括胃肠癌（除治愈级别C的胃癌）、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、乳腹膜炎、子宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌。国内方面，上海也早在2008年就为癌症患者提供基于先进肿瘤药敏检测的个体化化疗方法。医生可通过一张“肿瘤药敏报告单”为病人制定更加合理的化疗方案。江苏省也已经将肿瘤细胞化疗药物敏感试验（HDRA检测）纳入“江苏省基本医疗保险和工商保险诊疗服务项目、医疗服务设施范围和支付标准”。南京鼓楼医院肿瘤中心已经利用新鲜肿瘤组织三维培养药敏检测平台（HDRA）来指导药物选择。天津市于2013年颁布的《天津市基本医疗保险和生育保险诊疗项目暨医疗服务设施标准》中，将人体肿瘤SKC法药敏测定纳入医保范围（序号1254）。新疆省在最新公布的医疗服务价格项目中也提及了人体肿瘤SKC法药敏测定项目。由中国国家卫生和计划生育委员会最新发布的肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》更是对病人自体肿瘤细胞体外药敏检测中涉及的样本采集、分析质控、结果报告、诊断标准等进行了一整套规范化要求，为肿瘤治疗的精准化用药提供了重要保证。

3.3 存在的问题

3.3.1 细胞来源稀缺降低药敏检测通量

癌症药敏检测需要大量的癌细胞来源，而在手术过程中，肿瘤细胞并不能满足大量的药敏检测需要。同时，由于原代细胞分离技术的不完善，导致细胞获取的机会大大降低，严重影响了癌症组织体外药敏检测模型的大面积推广。

3.3.2 药敏检测技术的时效性

从应用角度讲，药敏检测结果应在病人需要进行化疗之前得出，以帮助病人指导用药。但现有原代细胞培养的技术并不完善，导致研究人员很难在短时间内得到大量的样本进行药敏检测。尤其对于一些病情恶化的患者，并没有过多的时间来等待检测结果。所以，如何能快速得到药敏测试结果也将是研究人员需要考虑的问题之一。

3.3.3 检测技术对体内的模拟程度

目前对于什么手段能够更好地模拟体内微环境仍然存在较大争议。但是作为肿瘤细胞体外培养模型，将来的应用方向是指导病人的用药与进行新药的开发，因此检验体外肿瘤培养模型是否能够准确有效地预测药物对体内肿瘤的杀伤效果是本领域的核心问题。而目前在这方面的研究还很薄弱，主要受限于原代细胞的分离、培养技术手段不成熟、实验周期长、体外体内药效较难比较等原因。但如果要将体外肿瘤模型推向医疗应用，这一系列难题需要被一一攻克。

3.4 展望

3.4.1 病人自体肿瘤细胞快速扩增技术的发展

癌症药敏检测需要大量的癌细胞来源，而手术获得的肿瘤细胞并不能满足高通量药敏检测的需求。所以，高通量癌症药敏检测需要在体外对癌细胞进行快速扩增，以达到所需的细胞量。而来自于病人的原代细胞并不容易适应体外环境，细胞存活、扩增都存在较大问题。研究人员通过在原代肿瘤细胞中加入不能分裂的成纤维细胞，调节癌细胞生长的微环境，使其拥有与体内更高的相似性，以期待最终癌细胞可以在体外存活并快速扩增。Liu等[14]通过对原代肿瘤细胞与无分裂能力的成纤维细胞共培养，并添加ROCK抑制因子的方式，来促进癌细胞以较快的速度生长，从而在短时间内扩增大量癌细胞。基于这种癌细胞快速扩增技术，Crystal等[15]开发出了能够快速确定当肿瘤产生单一药物抗药性后所应采用的联合用药方案。通过快速扩增技术得到大量病人源性肿瘤细胞的应用实例，见图3[15]。相较于通过单纯遗传分析的手段来寻找新的药物靶点，直接进行细胞毒性检测得到的结果更为直接，同时有助于发现新的有效药物。

3.4.2 体外3D肿瘤组织类器官药物筛选模型的优化

由于3D细胞培养规范化的模式尚未建立，因此需要优化现有系统以产生稳定可重复的检测结果。例如，通过引入细胞外基质材料来模拟体内环境可能会由于基质材料批次间的差异造成结果不稳定。因此实验前要注意检测其所含成分的差异。3D细胞培养所模拟的状态通常历时较短，然而在体内肿瘤的生成是长时间进程。验证体内肿瘤和体外模型的形成时间差异是否会对结果造成影响也是一个很关键的问题。在3D细胞培养中，细胞密度大，对营养的需求也会更高，但在3D培养条件中，这一需求并不能完全得到满足。和传统的2D平面培养细胞相比，单个细胞氧气和营养供应匮乏，影响细胞培养状态，可能致使实验重复性不佳，降低了3D模型的稳定性。3D体外模型缺乏复杂的脉管系统，而体内这些脉管系统通过简单扩散可以为组织提供氧、营养，并清除废物。所以在一个3D肿瘤组织体外模型进行表征时，也应当对系统内营养物质和废物的扩散能力进行表征。

3.4.3 在国内医疗体系中的发展趋势

随着对恶性肿瘤认识的不断深入，人们已经迫切的感受到精准医疗对于肿瘤诊治的重要性。尽管基于基因筛查的肿瘤精准医疗技术突飞猛进并受到世界范围内的广泛关注，但基于病人自体肿瘤细胞的药敏筛查技术仍处于发展阶段，受到的重视程度依然不足。然而，现阶段制约自体肿瘤药敏筛查的几个主要因素，如原代细胞稀缺、检测周期相对较长、体外模拟程度较低等问题均已取得重大突破。特别是体外三维培养肿瘤微组织模型的飞速发展更是极大的促进了药敏检测的准确性和有效性。我们有理由相信，在不久的将来，体外三维培养肿瘤微组织能够与基因筛查互为验证和补充，共同实现精准医疗的目标。

图3 通过快速扩增技术得到大量病人源性肿瘤细胞的应用实例[15]

致谢

本实验室的研究工作受到了国家自然科学基金（81171474、51273106、51461165302）和北京市自然科学基金（157142090）的支持。

[1] 何明燕,夏景林,王向东.精准医学研究进展[J].世界临床药物,2015,36(6):418-421.

[2] Mirnezami R,Nicholson J,Darzi A.Preparing for precision medicine[J].N Engl J Med,2012,366(6):489-491.

[3] 钱其军,吴孟超.肿瘤精准细胞免疫治疗:梦想照进现实[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2015,22(2):391-398.

[4] Collins FS,Varmus H.A new initiative on precision medicine[J].N Engl J Med,2015,372(9):793-795.

[5] 杭渤,束永前,刘平,等.肿瘤的精准医疗肿瘤的精准医疗:概念、技术和展望[J].科技导报,2015,33(15):14-21.

[6] 米彦军,张传钊,符立梧.肿瘤药敏试验指导个体化治疗的研究进展[J].药学学报,2009,44(11):1187-1192.

[7] Mcleod HL,Tan B,Malyapa R,et al.Genotype-guided neoadjuvant therapy for rectal cancer[J].Journal of Clinical Oncology,2005,23(16S):3024.

[8] Chang H,Rha SY,Jeung HC,et al.Association of the ABCB1 gene polymorphisms 2677G＞T/A and 3435C＞T with clinical outcomes of paclitaxel monotherapy in metastatic breast cancer patients[J].Ann Oncol,2009,20(2):272-277.

[9] Adjei IM,Blanka S.Modulation of the tumor microenvironment for cancer treatment:a biomaterials approach[J].J Funct Biomater,2015,6(1):81-103.

[10] ditFaute MA,Laurent L,Ploton D,et al.Distinctive alterations of invasiveness, drug resistance and cell-cell organization in 3D-cultures of MCF-7, a human breast cancer cell line, and its multidrug resistant variant[J].Clin Exp Metastasis,2002,19(2):161-168.

[11] 陈量,孙立,袁胜涛.肿瘤微环境中相关细胞的研究进展[J].现代生物医学进展,2011,11(21):4175-4177.

[12] Couzin-Frankel J.Hope in a mouse[J].Science,2014,346(6205): 28-29.

[13] Tanahashi M,Yamada T,Moriyama S,et al.The effect of the histoculture drug response assay (HDRA) based perioperative chemotherapy for non-small cell lung cancer[J].KyobuGeka,2008,61(1):26-30.

[14] Liu X,Ory V,Chapman S,et al.ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells[J].Am J Pathol,2012,180(2):599-607.

[15] Crystal AS,Shaw AT,Sequist LV,et al.Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer[J].Science,2014,346(6216):1480-1486.

Precise Medicine in Cancer Treatment via Patient Derived in Vitro Tumor Model

ZHU Lu1,2, GOU Yue-yang1, YAN Xiao-jun1, ZHOU Lv1, LIAO Quan3, WANG Bin4a, YE Chun-xiang4b, FENG Chang-jiang4c, DU Ya-nan1
1. Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China; 3.Department of Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China; 4.a. Department of Arthritis; b. Department of Gastroenterological Surgery; c. Department of Thoracic Surgery, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

The concept of precise medicine opens a new gate for cancer treatment. Nowadays, gene mutations possibly responsible for chemotherapeutic sensitivity can be pinpointed based on the Whole Genome Sequencing (WGS) technology to attack the tumor targeting to specific mutation. However, gene sequencing probably is not capable of providing the most suitable drug usage solution due to tumor genetic instability. In addition to the WGS, precise medicine also includes drug sensitivity testing. Chemo-sensitivity drug testing with patient derived primary tumorin vitromodel can provide more direct and accurate medical indication compared with the WGS because critical information for drug usage, such as pharmacological analysis and drug efficiency, can be acquired simply. The combination of genetic analysis andin vitromodel screening is helpful to fnd the most promising drug or drug combination for each patient and thus achieves the personalized medicine and increases tumor treatment effciency. This paper discussed the history, status, perspectives of current method of patient derived tumorin vitromodel.

precise medicine; patient derived tumor cells; drug sensitivity testing; 3D cell culture

R318

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.06.003

1674-1633(2016)06-0013-06

2015-10-30

2015-12-21

国家自然科学基金（81171474、51273106、51461165302），北京市自然科学基金（157142090）。

杜亚楠，教授。

通讯作者邮箱：duyanan@tsinghua.edu.cn