P2Y2受体激动剂 2-硫代-UTP及拮抗剂苏拉明对 Hela细胞活性影响

姜亚芳，司马赟，黄 婕

（苏州市吴中人民医院检验科，江苏 苏州 215128）

P2Y2受体激动剂 2-硫代-UTP及拮抗剂苏拉明对 Hela细胞活性影响

姜亚芳，司马赟，黄 婕

（苏州市吴中人民医院检验科，江苏 苏州 215128）

目的研究 P2Y2受体激动剂 2-硫代-UTP及其拮抗剂苏拉明对 Hela细胞活性的影响，从而在细胞水平探究P2Y2受体在人子宫颈癌病理生理过程中的作用。方法应用 CCK-8法检测不同时间点各处理组 Hela细胞的活性；ELISA法分别检测细胞上清液中 TNF-α和 IL-6的水平；qPCR和 Western blot法分别检测细胞 P2Y2mRNA和蛋白的表达变化。结果2-硫代-UTP可明显提高 Hela细胞的增殖能力。且经2-硫代-UTP处理后的细胞 IL-6的水平明显增加，P2Y2mRNA和蛋白表达水平均有所提高；苏拉明可明显抑制 Hela细胞增殖，经其处理后的细胞 TNF-α水平有所提高，P2Y2mRNA和蛋白表达水平无明显变化。结论2-硫代-UTP可通过激活 P2Y2受体的活化细胞，引起细胞过表达 P2Y2受体，从而促进 Hela细胞增殖。苏拉明可通过阻断 P2Y2受体及其下游活动，抑制Hela细胞增殖。以上结果表明，P2Y2受体可能成为治疗子宫颈癌等疾病的新靶点，这将为探索子宫颈癌新型治疗手段等方面提供新思路。

P2Y2受体； 2-硫代-UTP； 苏拉明； Hela细胞； 宫颈癌

随着人们生活节奏加快，子宫颈癌（cervical cancer）在中国女性群体中的发病率逐渐上升，已成为常见的妇科疾病之一，其发病率和死亡率已占世界的三分之一左右［1］。研究发现，子宫颈癌与HPV感染、p53和 Rb失活、端粒酶激活、抑癌基因表达失常、癌基因激活和炎性细胞因子等密切相关，是多基因改变，多步骤发生的一类全身性疾病，其发病机制尚未完全明确［2-4］。P2Y2受体是 G蛋白偶联受体家族的典型代表，广泛分布于正常组织中且具有组织特异性［5］。研究证明，P2Y2受体在多种癌症患者组织及细胞中均有表达，其中 Kyse-140食管癌细胞系、T47-D乳腺癌细胞系及Hela子宫颈癌细胞系等均可特异性表达P2Y2受体［6-7］，结合 P2Y2受体其在介导癌细胞的增殖，分化和转移等方面发挥重要作用，提示P2Y2受体可能参与子宫颈癌病理生理过程。2-硫代-UTP是 P2Y2受体的特异性激动剂，其可通过活化 P2Y2受体激活下游信号转导系统，P2Y2受体活化后也可与其他受体相互作用，从而影响其自身与 G蛋白发生偶联的能力［8-9］。P2Y2受体拮抗剂苏拉明可有效阻断 P2Y2受体功能及其下游活动，进而抑制P2Y2受体介导的生物学效应［10］。本研究通过特异性拮抗剂和激动剂处理 Hela细胞，在细胞水平上探究 P2Y2受体在 Hela细胞增殖过程中的作用，在研究子宫颈癌新型治疗靶点和手段等方面具有重要意义。

材料和方法

1 实验材料

人宫颈癌细胞（Hela细胞，KCB 86019YJ）由中国科学 院昆明 细胞 库提供。DMEM培养 基 由HyClone公司提供，小牛血清由四季青生物工程材料有限公司提供，2-硫代-UTP和苏拉明由索莱宝生物科技有限公司提供，TNF-α和 IL-6检测试剂盒由博士德生物工程有限公司提供，CCK-8细胞活性检测试剂盒由天根生化科技有限公司提供，山羊抗兔P2Y2多克隆抗体由Abcam公司提供，GAPDH单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，qPCR试剂盒由 TakaRa公司提供，总 RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。

2 实验分组

细胞所用培养基为DMEM完全培养基（含10%小牛血清和 1%青链霉素混合液），实验分为 3组，即：正常对照组、2-硫代-UTP处理组（50μmol／L）和苏拉明（100μmol／L）处理组，所用药物均用 DMEM基础培养基稀释，所用细胞均控制在30代以内。

3 CCK-8法检测细胞活性

按照实验所设分组，用96孔板接种细胞，密度约为1×104／mL，每孔100μL，每组设置5个复孔，共接种3块孔板。细胞贴壁后行药物干扰，每间隔6h进行一次细胞活性检测，检测8次，共48h。CCK-8储存液按1：10的比例DMEM基础培养基稀释，细胞处理后更换 CCK-8稀释液，每孔 100μL，于 37℃培养箱（5%CO2）孵育2h，450nm检测每孔的吸光度，以吸光度大小表示各组细胞活性，绘制细胞生长曲线。

4 细胞上清液中TNF-α和IL-6含量检测

结合细胞活性检测结果，取第24h时间点各组细胞上清液进行分析，所用方法为 ELISA双抗夹心法。吸取细胞培养液后，经4℃，1000r／min离心1min后取上清备用。按说明书所设标准品浓度用样品稀释液稀释标准品，检测样本不作稀释。后续步骤均按说明书进行，实验重复3次，结果使用多功能酶标仪在450nm波长读取。每次实验均绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中 TNF-α或 IL-6水平。

5 实时荧光定量PCR法检测P2Y2受体mRNA表达

根据细胞生长曲线，提取第 24h时间点各组细胞的总RNA，经逆转录试剂盒于37℃恒温水浴1h逆转录成 cDNA。实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）所用仪器为ABI 7500 FAST，所用方法为 SYBRⓇGreen荧光染料法。P2Y2上下游引物分别为：5′-GCTCCAATCTTGTCACCGAG-3′和5′-CTCGGCGCACTGTGAGGATC-3′，产物 长度为203bp；内 参 GAPDH上下 游 引 物 分别 为：5′-AGCTACCACGCCTAGTAGCGCAC-3′和5′-GTGTGT GATCAAGAACGTGTAGGCT-3，产物为151bp。所用PCR扩增程序为：94℃30s预变性，94℃ 5s变性和60℃30s退火，共40个循环；溶解曲线程序为：95℃15s，60℃ 1min，95℃ 30s，60℃ 15s。各组细胞mRNA相对表达量计算方法为 2-ΔΔCT法，将对照组标准化为1，以相对值（relative quality，RQ）表示P2Y2mRNA的相对表达量。

6Western blot法检测细胞EMAPII及CXCR3蛋白表达

取第24h时间点细胞，经 RIPA裂解液裂解后，提取细胞总蛋白。行 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后分别孵育一抗，4℃孵育过夜。P2Y2羊抗兔多克隆抗体稀释比例为1∶1000；GAPDH单克隆抗体稀释比例为1∶500。次日，经洗膜后分别孵育二抗，比例为1∶2000，常温孵育1h，再经洗膜后通过凝胶成像仪曝光显影，结果采用Image-Pro Plus 6.0分析软件分析。

7 统计学处理

实验中所有数据采用SPSS 21.0分析软件进行处理，所有数据用“均数±标准差”表示。计量资料用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验，以 P＜0.05表示有统计学差异。

结 果

1 细胞活性检测结果与生长曲线

各处理组细胞8个时间点的活性检测结果如表1所示，根据表1绘制细胞生长曲线（见图1）。结果显示，2-硫代-UTP处理组细胞较对照组生长速率明显加快，以第24h时间点生长速率出现最大值，且达到平台期所用时间也有所缩短。苏拉明处理组细胞生长速率均显著低于对照组和2-硫代-UTP处理组，且未出现细胞接触抑制现象。

表1 各时间点细胞活性检测结果（±s）

表1 各时间点细胞活性检测结果（±s）

时间点 样本数 对照组 2-硫代-UTP 处理组 苏拉明处理组6h 5 0.144±0.02 0.203±0.03 0.123±0.02 12h 5 0.288±0.04 0.435±0.04 0.224±0.03 18h 5 0.504±0.04 0.756±0.06 0.356±0.03 24h 5 0.821±0.06 1.024±0.09 0.625±0.07 30h 5 1.038±0.11 1.229±0.11 0.763±0.06 36h 5 1.181±0.10 1.337±0.13 0.831±0.10 42h 5 1.238±0.12 1.415±0.11 0.875±0.09 48h 5 1.258±0.11 1.442±0.12 0.894±0.11

2 各组细胞TNF-α和IL-6含量变化

取第24h时间点细胞培养液，根据标准曲线计算细胞上清液中 TNF-α和 IL-6水平，结果如表2所示，组间差异均有统计学意义。组间比较结果显示，与对照组相比，2-硫代-UTP处理组细胞的 IL-6水平显著提高（P＜0.01），而 TNF-α水平无明显变化（P＞0.05）；与之相反，苏拉明处理组细胞的TNF-α水平均较对照组和2-硫代-UTP处理组有所上升（P＜0.01），而 IL-6水平无明显变化（P＞0.05）。

表2 各组细胞 TNF-α和 IL-6检测结果（±s）

表2 各组细胞 TNF-α和 IL-6检测结果（±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01

组别 样本数 TNF-α（pg／mL）IL-6（pg／mL）3 45.67±7.52 22.57±5.83 2-硫代-UTP处理组 3 49.89±6.57 79.25±9.34**苏拉明处理组 3 115.29±11.65**26.09±4.75 F2，6值 46.268 37.864 P值对照组＜0.001 ＜0.001

3 苏拉明和2-硫代-UTP对Hela细胞P2Y2mRNA表达的影响

将对照组标准化为1，使用 2-ΔΔCT法分析qPCR数据。结果显示，第24h时间点的各处理组细胞P2Y2mRNA的相对表达量分别为：2.56±0.16，1.20±0.14，方差分析比较有统计学意义（F2，12＝44.237，P＜0.001）；组间比较显示，2-硫代-UTP处理组细胞P2Y2mRNA表达均较对照组和苏拉明处理组有所升高（P＜0.01），而苏拉明处理组与之相比无显著变化（P＞0.05）。

4 苏拉明和2-硫代-UTP对Hela细胞P2Y2受体蛋白表达的影响

SDS-PAGE电泳条带典型图如图 2A所示。Western blot结果分析显示，第 24h时间点的各处理组细胞 P2Y2蛋白相对表达量分别为：0.45±0.07，0.83±0.09和0.50±0.07，组间差异有统计学意义（F2，12＝37.264，P ＜0.001）；进一步分析显示，与对照组相比，2-硫代-UTP处理组细胞P2Y2蛋白表达明显升高（P＜0.01），而苏拉明处理组与对照组无明显差异（P＞0.05，见图2B）。

讨 论

子宫颈癌是女性群体高发肿瘤疾病之一，仅次于乳腺癌，位列女性恶性肿瘤的第二位。中国是子宫颈癌高危大国，近年来其发病率和死亡率呈逐年上升趋势［1］。目前，子宫颈癌发病机制尚未完全阐明，探索新型有效的治疗靶点对防治子宫颈癌等疾病具有重要意义。P2Y受体家族是一类具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体，目前已从哺乳动物细胞中成功克隆出8种功能性 P2Y受体亚型，I类受体包括P2Y1、P2Y2、P2Y、P2Y、P2Y，II类受体包括 P2Y～P2Y［11-12］。

46111214近年来研究发现，P2Y受体家族尤其是P2Y2受体，在多种癌症组织和细胞中均有表达，并在癌细胞的增殖，分化和转移等活动中扮演重要角色［13-14］。根据不同时间点的细胞活性检测结果绘制各处理组细胞生长曲线，从中可以看出，正常生长的 Hela细胞生长曲线呈典型的“S”状，而2-硫代-UTP处理组细胞指数生长期的斜率大于对照组，且其到达平台期所用的时间明显比对照组缩短，即2-硫代-UTP可通过激活 P2Y2受体功能促进Hela细胞增殖。与之相反，经苏拉明处理后的细胞生长速率明显减慢，且细胞未达到接触抑制时即出现平台期，表明苏拉明通过阻断P2Y2受体功能可抑制了Hela细胞活性。

研究发现，P2Y受体激活后可进一步活化不同的G蛋白，进而引发复杂的信号转导途径［15］。P2Y2受体可通过激活 Gq／11或 Gi／o等类型的 G蛋白，激活PLC途径，介导胞内 Ca2＋和炎性介质释放，进而激活下游NF-κB转录因子及CaMKII，最终产生促增殖效应或介导细胞凋亡［16］。也有研究认为，2-硫代-UTP可通过P2Y2受体引起 APE1／Ref-1活化，或导致受体本身过表达［17］。从细胞生长曲线可看出，各处理组细胞均在第24h时间点生长速率达到最大值，因此我们选择检测第 24h时间点各组细胞 P2Y2受体表达情况。我们通过 qPCR和 Western blot实验确定了在Hela细胞中可表达 P2Y2受体，且经 2-硫代-UTP处理后的细胞中P2Y2受体 mRNA和蛋白表达均明显增加，表明 2-硫代-UTP在激活P2Y2受体功能的同时也可上调其受体本身的表达，而苏拉明处理组中以上指标均无显著变化。

ELISA结果显示，经2-硫代-UTP处理后的细胞IL-6水平明显升高，苏拉明处理组细胞也观察到了TNF-α释放量的增加。结合 IL-6与细胞活化和增殖相关，尤其是其可作为生长因子刺激肿瘤细胞，特别是骨髓瘤细胞的增殖和迁移以及 TNF-α能显著杀伤肿瘤细胞活性［18-19］等研究背景，推断 P2Y2受体对Hela细胞活性的影响可能与其介导 IL-6或 TNF-α等炎性介质相关。

综上所述，本研究发现P2Y2受体功能激活能促进Hela细胞增殖，阻断其受体功能可显著抑制 Hela细胞活性。这将为研究新型有效的抑癌靶点及探索子宫颈癌潜在的治疗手段等方面提供科学依据。

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（潘子昂编辑）

Effects of P2Y2Receptor Agonist 2-thio-UTP and Antagonist Suramin on the Activity of Hela Cells

JIANG Ya-fang，SIMA Yun，HUANG Jie
（Department of Clinical Laboratory，Wuzhong People′s Hospital，Suzhou，215128，China）

ObjectiveTo investigate the effect of P2Y2receptor agonist 2-thio-UTP and antagonist suramin on the activity of in human epithelial adenocarcinoma cell line（HeLa）and to explore the role of P2Y2receptor in the pathological and physiological processes of cervical cancer in the cell level.MethodsCell counting kit-8（CCK-8）assay was used to detect the activity of Hela cells in different time points；ELISA method was used to detect the content of TNF-α and IL-6 in the supernatants of cell；qPCR and Western blot method were used to detect the expression of P2Y2mRNA and protein，respectively.Results2-thio-UTP can significantly improve the proliferation of Hela cells.The content of IL-6 in the supernatants of cell increased significantly after 2-thio-UTP treatment.The expression of P2Y2mRNA and protein were also increased.Suramincan significantly inhibit the proliferation of Hela cells，and the content of TNF-α was increased.However，the expression of P2Y2mRNA and protein did not change significantly.Conclusion2-thio-UTP can activate Helacells via P2Y2receptor，and up-regulate the expression of P2Y2receptors.As a result，it promotes the proliferation of Hela cells.Suramin could inhibit the proliferation of Hela cells by blocking the P2Y2receptor and its downstream activities.These results suggested that P2Y2receptor might be a new target for the treatment of cervical cancer and other diseases.The study provides a new idea for the exploration of new therapeutic methods for cervical cancer.

P2Y2receptor； 2-thio-UTP； Suramin； Hela cell； Cervical cancer

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.007

2016-07-21；

2016-08-12