pH值、温度和盐度对墨吉明对虾蛋白酶和淀粉酶活力的影响

■郭文浚 杨世平 刘慧玲王成桂 孙成波

（广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088）

墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)隶属于十足目(Decapoda)、枝鳃亚目(Dendrobranchiata)、对虾科(Penaeidae)、明对虾属(Fenneropenaeus)，遍布在亚洲和澳大利亚的热带及亚热带海域，在我国主要分布于东南沿海等海域。其食性较杂，生长周期较短，具有肉质鲜美、个体较大、经济效益较高和生长迅速等特点，也是中国传统的经济对虾品种[1]。21世纪70年代开始，一些机构开展了墨吉明对虾幼体培育、疾病防治等研究。但由于凡纳滨对虾引进后迅速形成了规模化养殖，影响墨吉明对虾的养殖规模和研究进展。近年来，由于凡纳滨对虾养殖中病害的暴发，影响了对虾产业的发展，墨吉明对虾的研究再次被关注，包括养殖生态、病害防治、胚胎发育、幼体发育、代谢等研究[2-7]。

关于水生经济动物消化酶的研究较多，如中国龙虾(Panulirus stimpsoni)[8]、凡纳滨对虾(Litopenaeus van⁃namei)[9-11]、中国明对虾(P.chinensis)[12]、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)[12]、虎纹蛙(Hoplobatrachus ru⁃gulosus)[13]等，说明消化酶的研究在基础研究中的重要性。鉴于有关墨吉明对虾消化酶的资料尚缺，本文研究不同pH值、温度和盐度条件下，墨吉明对虾肝胰脏和肠道中淀粉酶和蛋白酶的活力变化规律及最适条件，为墨吉明对虾人工养殖和配合饲料的开发提供依据，促进墨吉明对虾的规模化养殖技术的发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

墨吉明对虾[体长（10.0±0.5）cm]采自广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地，选取健康无损伤的活泼个体，置于预先充氧的桶内暂养，并保持24 h不投喂饲料，使其处于长时间不进食状态，令肠道内食物残渣基本排出至无残渣状态。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

随机选取50尾对虾，将活体置于冰浴的培养皿内解剖，取出其肝胰脏，随后取出肠道并用预冷蒸馏水（约4℃）将肠道内未能排出的残渣冲洗干净，用吸水纸分别吸干表面多余的水分。然后将50尾虾的肝胰脏、肠道样本分别混合在一起，接着，按照其质量加入9倍体积（m/V）预冷蒸馏水，用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆。充分匀浆后，将匀浆液置于5 000×g、4℃离心机中离心15 min，最后取上清液（即酶粗提取液）置于-20℃冰箱中保存待测酶活力。

1.2.2 酶活力的测定

采用黄耀桐等[14]方法改良后对蛋白酶活力进行测定，而淀粉酶活力则采用荣俊等[15]方法进行改良测定。酶活力则统一用酶的比活力来表示，即酶的比活力=酶活力单位/该粗酶液中蛋白质的含量（U/mg prot.）。蛋白酶与淀粉酶测定均设置pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的10个pH值梯度，温度为25、30、35、40、45、50、55 ℃和60 ℃的8个温度梯度，盐度为0、10、20、30、40、50、60和70的8个梯度。总蛋白质含量测定，采用考马斯亮蓝试剂盒（南京建成生物科技有限公司）按说明书操作。

1.3 数据处理

数据以“平均值±标准差”表示。再用EXCEL 2010和SPSS 21.0软件进行方差分析和Ducan's法多重比较，P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pH值对墨吉明对虾消化酶的影响（见表1）

表1 pH值对墨吉明对虾淀粉酶和蛋白酶的影响（U/mg prot.）

如表1所示，在试验设计pH值范围内，墨吉明对虾肝胰脏和肠道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均随着pH值的升高呈现先升高后下降的的趋势，在pH值6.0时，不同组织中两种酶的比活力达到最大值。因此，认为两种酶的最适pH值都是6.0，属于偏弱酸性酶。从消化酶的比活力来看，在相同条件下，肝胰脏和肠道中蛋白酶的比活力相近，而在肝胰脏中淀粉酶的比活力高于肠道中。

2.2 温度对墨吉明对虾消化酶的影响（见表2）

表2 温度对墨吉明对虾淀粉酶和蛋白酶的影响（U/mg prot.）

由表2可知，在试验设计温度范围内，墨吉明对虾肝胰脏和肠道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均随着温度的升高呈先升高后下降的趋势。两种组织中蛋白酶的比活力的最大值出现在55℃时，而两种组织中淀粉酶的比活力的最大值出现在40～45℃时。在相同温度条件下，肝胰脏中淀粉酶的比活力高于肠道中的酶活力，达肠道中的3.52～4.88倍。两种消化酶的最适温度都显著高于墨吉明对虾正常的栖息水温，符合水生动物消化酶特性。

2.3 盐度对墨吉明对虾消化酶的影响（见表3）

表3 盐度对墨吉明对虾淀粉酶和蛋白酶的影响（U/mg prot.）

由表3可知，在盐度为0～70范围内，随着盐度的升高两种组织中的消化酶均出现先上升后下降的趋势。在盐度40时，两种组织中的蛋白酶的比活力均显著高于其它盐度条件下的比活力（P＜0.05），而淀粉酶的比活力却是在盐度10条件下显著高于其它盐度条件下（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 pH值对墨吉明对虾消化酶的影响

pH值是影响酶活力的一个因素，主要是通过改变蛋白酶的构象使其失活，或者影响酶分子侧链上极性基团的解离从而使酶活性中心结构发生变化影响产物的生成[16]。本研究结果表明，pH值对墨吉明对虾消化酶活力都有影响，在试验设计pH值范围内均呈现消化酶活力先升高后降低的趋势。

大多数生物学者认为海洋甲壳动物消化酶最适pH值范围大约在5.0～7.9[17]，与本试验测得结果相近。本试验测得墨吉明对虾肝胰脏和肠道中蛋白酶的最适pH值都是6.0，属于偏弱酸性的酶，与黄燕华等[9]在凡纳滨对虾上的研究结果相似，与姜永华[8]等研究中国龙虾、胡毅等[17]研究三疣梭子蟹(Portunus tritu⁃berculatus)时，发现的最适pH值约为4.0左右有差异，这可能是物种之间的差异所致。李广丽等[18]测定的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)以及姜鹤等[19]测得大连虾蛄(Oratosquilla oratoria)的数据也进一步证实淀粉酶在偏弱酸性条件下最适合促进反应的进行。研究发现，不同物种的消化酶最适pH值可能不同，这可能与不同物种的生活习性、生活环境的不同，以及自身遗传物质不同而形成不同代谢方式，使得自身内部酶的性质也形成差异，甚至不同生长发育阶段其消化酶活力也会发生变化[17]。

3.2 温度对墨吉明对虾消化酶的影响

众所周知，酶活力会受到温度影响。对虾是变温动物，水温是决定对虾体温的最主要因素，可以直接影响到对虾体内消化酶活力。温度影响酶促反应速率主要是通过在适当温度范围内，温度会使活化分子增多从而加快酶促反应，其次是因为大部分酶本质为蛋白质，会随着温度升高而逐渐变性甚至完全失活而影响酶促反应的效率[16]。

本试验测得墨吉明对虾肝胰脏和肠道中蛋白酶的最适温度都为55℃，与沈文英等[10]研究的凡纳滨对虾最适温度50～60℃，吴根等[12]研究的中国明对虾、日本囊对虾的最适温度为45～55℃的结果较为相近。淀粉酶最适温度测得为40～45℃，高于姜鹤等[19]在研究大连虾蛄的最适温度为30℃，也高于沈文英等[10]研究的凡纳滨对虾最适温度为30～35℃，这可能是墨吉明对虾生活环境温度较高，受到环境长期影响所致。有实验表明，墨吉明对虾适合生长温度为26～27℃[20]，墨吉明对虾肝胰脏和肠道的两种消化酶的最适温度均比栖息水温要高，尤其是蛋白酶。在杂色鲍(Hali⁃otis diversicolor)[21]、驼背鲈(Cromileptes altivelis)[22]和海蜇(Rhopilema esculenta)[23]等常见的水生动物中也发现类似结论。消化酶的比活力是在实验室规定条件下进行测定，受到反应时间等的限制，而实际上虾体内消化酶起作用时间要更长，同时，其分泌量会受到外界温度影响。因此，和最适pH值一样，消化酶的最适温度只有在一定条件下才有生物学上的意义。

3.3 盐度对墨吉明对虾消化酶的影响

本研究发现，蛋白酶最适盐度为40，盐度为40～60时，蛋白酶活性都有显著差异(P＜0.05)。淀粉酶最适盐度为10，盐度为0～60时，淀粉酶都有差异。从两种酶活力变化来看，说明蛋白酶对于盐度变化耐受性更好并且活力相对比较稳定，而淀粉酶受到盐度变化的影响更大，可能与蛋白酶和淀粉酶的结构有关，具体原因有待进一步研究。李希国等[24]研究黄鳍鲷（Sparus latus）幼鱼消化酶活性时，也发现蛋白酶的最适盐度高于淀粉酶。

4 结论

蛋白酶和淀粉酶最适pH值为6.0，最适温度为55℃和40～45℃，最适盐度为40和10。