高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定饲料中的无机砷及其他砷形态

■许锦华

（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002）

砷是一个与环境和人体健康关系密切的有害元素，砷的生物毒性不仅与其含量有关，与其存在形态更是密切相关，不同形态的砷化合物的毒性差异很大[1-3]。亚砷酸盐[As(Ⅲ)]、砷酸盐[As(Ⅴ)]、单甲基砷酸[MMA]、二甲基砷酸[DMA]和砷甜菜碱(AsB)是自然界常见的砷形态。它们的毒性排序为：As(Ⅲ)＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA，砷甜菜碱常被认为是无毒的。最近的研究显示，MMA和DMA可能会诱发DNA被氧化，其毒性可能会超过无机砷[4]。它们易在食用者或饲用者体内积累[5]，而且DMA又被认为是潜在的致癌因子。

有机砷作为动物抗病原微生物和促生长类饲料添加剂，对于提高畜禽的饲料利用率、增强抗病能力有着明显作用，被普遍添加于饲料中。无机砷虽然在现代动物营养学研究中被认为和硒、碘一样，是动物机体的一种必需元素，但却是一种有毒有害元素，对畜禽动物的危害性很大，因此饲料卫生标准中对无机砷有严格的限制要求，即≤3.0 mg/kg。

目前测定饲料无机砷的方法主要是用氢化物原子荧光分光光度计进行测定[6]。该方法测出来的无机砷含量往往会偏高，这是由于在分离提取过程中部分有机砷也会被提取出来，在盐酸长时间浸泡过程中，导致砷形态的转化；无机砷测定过程中部分有机砷也会产生氢化物。为了解决上述问题，近年来，色谱联用技术被广泛应用于砷元素形态分析。国内外常采用高效液相色谱（HPLC）与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子荧光光谱（AFS）等[7-9]技术分析砷形态化合物。ICP-MS具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽等优点，近年来已成为重要的元素检测分析手段。HPLC与ICP-MS联用技术已经成为元素形态分析最常用和有效的方法之一，对于砷形态分析而言，在灵敏度、分离效能方面最具优势。

本文采用HPLC-ICP-MS进行五种砷形态的分离分析，采用水为提取剂，在封闭环境下加热提取，针对饲料样品基质复杂的问题，采用C18小柱净化，实现了饲料样品五种砷形态的准确测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1100高效液相色谱（安捷伦科技有限公司）；Agilent 7500a型电感耦合等离子体质谱（安捷伦科技有限公司）；MARS 5微波消解仪（美国CEM公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Avanti J-E冷冻高速离心机（BECKMAN）；ST 2100/3C Pro-F型pH酸度计（美国奥豪斯）；XK-80A快速混匀器（新康医疗器械有限公司）；DKQ-4型智能控温电加热器（上海屹尧微波化学技术有限公司）；Sartorius BSA224S电子分析天平（赛多丽斯科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（Milipore公司）。

试剂：超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；硝酸（优级纯，CNW公司）；无水乙酸钠（分析纯）；硝酸钾（分析纯）；磷酸二氢钠（分析纯）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯）；氨水（分析纯）；无水乙醇（色谱纯）；砷标准物质：亚砷酸根[As(Ⅲ)]（GBW 08666）、砷酸根[As(V)]（GBW 08667）、一甲基砷酸（MMA）（GBW 08668）、二甲基砷酸（DMA）（GBW08668）、砷甜菜碱（AsB）（GBW 08669）（中国计量科学研究院）；砷标准贮备液（1 000 μg/ml，国家有色金属及电子材料分析测试中心）；调谐液（10 μg/l锂、钇、铊标准溶液）。

1.2 液相色谱及ICP-MS条件

色谱柱：阴离子分析柱Dionex IonPac AS19（250 mm×4.0）；阴离子保护柱IonPac AG19(50 mm×4.0)；

流动相：A相：10 mmol/l无水乙酸钠，3 mmol/l硝酸钾，2 mmol/l磷酸二氢钠，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二钠，用氨水调节pH值10.7；B相：无水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗；流速：1.0 ml/min；进样量：25 μl。

ICP-MS工作条件：功率1 350 W；载气流量0.65 L/min；补偿气流量0.45 L/min；采样深度7.0 mm；采集质量数75。

1.3 饲料中砷形态的提取

取饲料样品过40目筛待用。称取该饲料样品1 g（准确至0.001 g）于50 ml离心管中，加入24 ml超纯水，涡旋混匀，置于95℃烘箱中加热提取2.5 h，每隔0.5 h涡旋1次。提取完后，冷却至室温，加入3%（v/v）乙酸溶液1 ml混匀沉淀蛋白，于4℃以10 000 r/min转速离心5 min，取上清液用0.45 μm水系滤膜过滤及C18小柱净化后上机测试。

1.4 总砷含量的测定

称取过筛后的饲料样品0.5 g（准确至0.001 g）于聚四氟乙烯消解罐内，加入6 ml硝酸和2 ml盐酸，将消解罐盖旋紧后，放入微波消解仪中，微波消解程序见表1。样品消解完成，冷却后打开消解罐，置于赶酸器（温度设置为160℃）中赶酸，待消解液浓缩剩余2 ml左右，将其移入50 ml比色管，以少量去离子水清洗消解罐3次以上，洗液一同并入容量瓶中，定容、摇匀，同时做试剂空白。用电感耦合等离子体质谱测定总砷。

表1 微波消解程序

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

砷形态是以阴离子形式存在，因此选择阴离子交换柱进行分离，磷酸盐溶液进行等度淋洗，pH值和磷酸盐浓度均会影响目标砷形态的分离度，在流动相中加入少量的甲醇或乙醇，都能对砷的检测起到增敏效应，提高砷的电离效率及灵敏度，考虑到乙醇对人体的伤害较小，因此实验选择在淋洗液中加入1%乙醇，可以有效地将灵敏度提高1倍以上。在流动相：A相：10 mmol/l无水乙酸钠，3 mmol/l硝酸钾，2 mmol/l磷酸二氢钠，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二钠，用氨水调节pH值10.7；B相：无水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗下，能够实现5种砷形态分离，分离度和保留时间均可以达到试验要求。图1为选用该流动相的5种砷形态标准品与样品色谱图。

图1 砷形态色谱图

2.2 方法线性范围及检出限

按试验方法，对质量浓度分别为0、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/l和50.0 μg/l的5种形态砷混合标准溶液进行HPLC-ICP-MS分析，以砷形态的峰面积对浓度进行线性回归，结果表明：在0～50.0 μg/l的范围内，各种砷形态的线性回归方程相关系数均在0.999以上。以3倍色谱峰信噪比S/N计算得到5种无机砷形态的仪器检出限见表2，在试样取样量为1 g，定容体积为25 ml时，方法检出限（按仪器检出限×稀释倍数计算）结果见表2。

2.3 饲料中砷形态的提取效率

砷形态的提取方法有水、甲醇-水、酶提取、酸提取等[10-12]。热水提取，是一种传统的砷形态提取方法，不会造成砷形态的转化。试验采用水做为提取剂，密闭加热提取，对提取温度和提取时间进行优化。为了考察砷形态的提取效率，试验通过比较微波消解-ICP-MS方法测定的总砷（见表3）与HPLC-ICP-MS测定的总砷，提取效率为88.7%～104%，说明95℃中热浸提2.5 h可以有效地提取饲料中的砷形态。

2.4 方法回收率及重现性

为考察方法的回收率和砷形态化合物的稳定性，按试验方法对饲料样品进行3个添加水平的加标回收试验，结果见表4。从表4可以看出，5种形态砷化合物的加标回收率在88.6%～105%之间，相对标准偏差在2.1%～6.7%（平行测定6次）。说明热提取方法不会造成砷形态的转化。

2.5 饲料中砷形态分布

采用所建立的方法测定12个饲料样品中的5种砷形态化合物，检验结果见表3。从试验结果可知，饲料中的总砷含量在0.46～3.92 mg/kg之间，砷形态以砷甜菜碱（AsB）为主，个别样品含有DMA和无机砷，无机砷含量远远低于其限量值。

3 结论

试验建立了热水浸提，C18小柱净化，阴离子交换色谱与电感耦合等离子体质谱联用方法测定饲料中5种砷形态的方法。通过测定12个饲料的砷形态，发现饲料中的砷形态以有机砷为主。HPLC-ICP-MS测定饲料中无机砷含量的分析方法，具有灵敏度高、准确性好等优点，是检测饲料无机砷的有效方法之一。

表2 线性范围及检出限

表3 饲料样品中砷形态分布（mg/kg）

表4 饲料样品中5种砷形态的加标回收率和相对标准偏差(%)(n=6)