降解含聚丙烯酰胺采油污水的菌种筛选*

马少华，杨艳丽

（陕西国防工业职业技术学院化学工程学院，陕西西安710300）

降解含聚丙烯酰胺采油污水的菌种筛选*

马少华，杨艳丽

（陕西国防工业职业技术学院化学工程学院，陕西西安710300）

生物降解法处理含聚丙烯酰胺（PAM）采油污水具有高效、成本低、环保等优点。本文采用富集培养和平板分离的方法，并结合初筛和复筛实验，以聚丙烯酰胺降解率为指标从采油废水中分离出了具有聚丙烯酰胺降解能力的三株菌株分别编号为4号、8号、11号。

聚丙烯酰胺；采油污水；生物降解

聚丙烯酰胺（PAM）是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的统称，为线性水溶性高分子，能以各种浓度溶于水，不溶于大多数有机溶液[1]。PAM具有良好的吸附、絮凝、增稠作用，广泛的被应用于石油开采、废水处理、纺织印染、造纸、冶金等行业。随着聚丙烯酰胺在三次采油中应用技术的推广，含聚丙烯酰胺采油污水量也在逐年增加。PAM降解会产生大量的低聚物，低聚物进一步降解会产生大量的丙烯酰胺单体，而丙烯酰胺是一种有毒化学物质，对其毒性国内外已进行大量的研究[2]。由于其良好的水溶性，排入环境的丙烯酰胺基本上进入地表水和地下水中，可以通过皮肤、黏膜、呼吸道和口腔被吸收，广泛分布在人的体液中，也能进入胚胎中，引起中毒。因此，含PAM采油污水的处理已成为油田环境污染面临解决的一个重要问题。

据文献[3]报道，目前处理含PAM废水的方法主要物理化学法和生物降解法。而生物降解法具有高效、成本低、环保等优点，已成为研究的重点。本文主要研究聚丙烯酰胺降解菌的分离、筛选，以聚丙烯酰胺降解率为指标从含聚丙烯酰胺的采油废水中筛选出高效降解聚丙烯酰胺的菌株。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

NaCl（AR）、CaCl2（AR）、（NH4）2·SO4（AR）、KH2PO4（AR）、K2HPO4（AR）、琼脂（生化试剂）、酵母浸粉（生化试剂）、MgSO4（AR）、蛋白胨（生化试剂）、牛肉浸膏（生化试剂）、聚丙烯酰胺（400万ppm）。

超净工作台；DHP030型恒温培养箱；TF-1A型生化培养箱；ZDX-35B型座式电热压力蒸汽灭菌器；UV-2100型分光光度计；SHZ-82型气浴恒温振荡器；JA型系列电子精密天平；PHS-3C型数显酸度计、培养皿、接种环、刮铲等。

1.2 实验方法

首先，进行样品的采集，采集到的样品中微生物的含量不一定很高，需要对其中的微生物进行富集，使其大量繁殖。样品中的微生物种类很多，需要对它们进行分离。然后继续分离、纯化得到纯种。再进行降解实验，以聚丙烯酰胺的降解率为指标，筛选出能降解聚丙烯酰胺的菌株。图1是聚丙烯酰胺降解菌的分离和筛选流程图。

图1 聚丙烯酰胺降解菌株的分离和筛选流程Fig.1 Isolation and screening process of polyacrylamide degradation strain

1.2.1 实验样品来源本实验所用采油废水样品来自胜利油田聚合物驱采油废水。

1.2.2 富集培养在无菌操作下，取1mL采油废水加入到装有50mL灭菌富集培养基的150mL三角瓶中，然后在恒温摇床中进行培养（30℃，120 r· min-1）。待培养液发生混浊时，用无菌移液管吸取1mL，转接到另一装有50mL灭菌富集培养基的150mL三角瓶中培养，如此连续转接3～6次，最后就得到富集培养目的菌占绝对优势的微生物混合培养物。本实验每次接种后培养约24h，培养基即出现浑浊，再转接到下一富集培养瓶中进行恒温培养。

1.2.3 菌株分离采用平板划线分离法[4]对聚丙烯降解菌株进行分离。将融化并冷至约50℃的培养基在无菌操作下倒入无菌的空培养皿内，加盖，轻轻转动平板，凝固后即成所需的平板。以无菌操作进行划线接种，划线完毕后，将培养皿盖好。倒置培养皿于30℃恒温培养箱内培养观察结果。接种环用过后应立即经烧灼灭菌才能放于桌面或再进行接种操作。

培养48h后，发现接种平板上有菌落长出。选取菌落湿润、圆整、表面光滑、边缘整齐、凸出且个体较大的菌落进行二次平板划线分离，二次平板划线培养基选用分离培养基。二次平板划线时，将培养基一分为二并编号。每一半培养基上接种上述具有明显特征的菌落，共接种11个单菌落，再将接种平板置于30℃恒温培养箱中进行培养，48h后发现有菌落长出。

1.2.4 菌株筛选将上述经平板划线分离获得的菌种，培养一段时间后，选择培养液比较混浊的培养基进行进一步筛选。找到较混浊的培养基后，采用淀粉-碘化镉分光光度法测定溶液中聚丙烯酰胺的浓度[5]，以聚丙烯酰胺的降解率为指标，筛选出降解能力高的菌株。

2 结果与讨论

2.1 聚丙烯酰胺降解菌株的分离

观察样品富集后的菌液在第二次平板划线分离时各接种菌落在24h和48h的生长情况。所分离的各菌株在分离培养基上的生长状况差异较大，选取其中的11株生长较快，且其菌落湿润、圆整、表面光滑、边缘整齐、凸出且个体较大的菌落进行初筛实验。

2.2 聚丙烯酰胺降解菌株的筛选

2.2.1 初筛从样品中分离出的11种菌株中，选取生长旺盛的菌株进行初筛实验。其中将编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11号的菌株分别接入到50mL液体筛选培养基中进行培养实验，接种液置于30℃恒温摇床（120r·min-1）培养72h。然后目测培养基混浊程度。聚丙烯酰胺降解菌株的初筛实验结果见表1。

表1 聚丙烯酰胺降解菌株的初筛实验结果Tab.1 Screening results of polyacrylamide degradation strain

由表1可见，3、4、5、8、11号菌株能够在以聚丙烯酰胺为唯一的碳源，氮源中生长，可以初步判断这5种菌株具有一定聚丙烯酰胺降解能力。

2.2.2 复筛将初筛选出的5种菌株分别接种到50mL的液体筛选培养基中，在30℃恒温摇床培养72h。测定各菌株的培养菌液接种后培养前后聚丙烯酰胺的浓度，计算出聚丙烯酰胺降解率，结果见表2。

表2 聚丙烯酰胺降解菌株的复筛实验结果Tab.2 Rescreening results of polyacrylamide degradation strain

由表2可见，4#、8#和11#菌株的降解率较高。为了对比这3种菌株，重新对这3种菌株进行复筛实验（50mL筛选培养基，30℃恒温摇床，120r·min-1，培养时间为72h），且每种菌株设3次平行。复筛对比实验结果见表3所示。

表3 聚丙烯酰胺降解菌株的复筛对比实验结果Tab.3 Comparative rescreening results of polyacrylamide degradation strain

由表3可见，3种菌株的平行样品间聚丙烯酰胺的降解能力有所差别，这主要可能与在接种时采用接种环直接挑取斜面菌株的接种方法有关。因为在挑取菌株时，挑取菌量不同，直接导致菌液中的细菌生长繁殖的程度有所不同，造成各菌株平行样间的有所差异。三空白样降解率的差异不大。

由第二次复筛结果可见，3种菌株都有一定的聚丙烯酰胺降解能力，可见第一次复筛选出的4#、8#、11#菌株的确具有能力降解聚丙烯酰胺。

2.3 聚丙烯酰胺降解菌在样品废水中的应用

将4#，8#，11#菌株菌液接种到50mL样品来源水中，即胜利油田采油废水中，在30℃下培养72h，测定采油废水中聚丙烯酰胺的降解率，平行做3组试验，实验结果见下表4。

表4 采油废水中聚丙烯酰胺的降解率Tab.4 Polyacrylamide degradation rate of oil production wastewater

由表4可以看出，所筛选的3株聚丙烯酰胺降解菌在采油废水中都有降解聚丙烯酰胺的能力，但它们的降解率都不高。这与培养基实验所得结果相差较大，原因可能是采油废水中的营养条件与培养基的不同，如矿化度，碳源、氮源等；还有采油废水中可能有对聚丙烯酰胺降解菌不利的物质。

3 结论

本实验采用富集培养、平板分离以及初筛和复筛方法，以聚丙烯酰胺降解率为指标从采油废水中分离出有聚丙烯酰胺降解能力的3种菌株，分别编号为4#、8#、11#。这3种菌株在以聚丙烯酰胺为唯一碳源、氮源的培养基中生长并且具有一定的PAM降解能力。实验中聚丙烯酰胺降解菌对PAM降解率有20%左右，在实际应用上最高才达到7.8%，比一些资料的50%要低一些。我们在后续的研究工作中，将重点进行以下研究：（1）考察培养时间、pH、温度等条件对菌株降解能力的影响，优化培养条件；（2）对所筛选的菌株进行一定的鉴定与分类，并对降解能力做理论研究与优化工作。

［1］严瑞瑄.水溶性高分子［M］.北京：化学工业出版社，1998.84-178.

［2］黄君礼.丙烯酰胺的毒性及其分析方法［J］.环境科学丛刊，1991，12（4）：37-43.

［3］温沁雪，赵晔.油田含聚丙烯酰胺废水处理研究进展［J］.化工环保，2009,29（1）：39-42.

［4］周群英，高廷耀.环境工程微生物学［M］.北京：高等教育出版社，2004.122-132.

［5］田利,邹明珠,许宏鼎,等.采油污水中部分水解聚丙烯酰胺浓度的测定［J］.吉林大学学报（理学版）,2003,41（2）:224-227.

Strain screening of degradation of oil production sewage containing polyacrylamide

MA Shao-hua，YANG Yan-li
（Department of Chemical Engineering,Shaanxi Guofang Institute of Technology,Xi'an 710300,China）

The advantage of biodegradable processes used for treatment of polyacrylamide（PAM）contained in oil production sewage is high efficiency,low cost,and environmental protection.In this paper,using enrichment culture and the separation of the plate and,combined with first and second screen experiment,to polyacrylamide degradation rate of oil production from wastewater indicators were isolated with the ability of polyacrylamide degradation of the three bacteria,No.4,8,and 11 respectively.

polyacrylamide；oil production sewage；biodegradable processes

X52

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161206

2016-09-08

陕西国防工业职业技术学院研究与开发项目（Gfy16-37）

马少华（1986-），女，汉族，河南省许昌市人，讲师，硕士，从事石油化工与安全环保方面研究工作。