一种去除猪圆环病毒中支原体污染的方法

张雅会，李少丽，李艳丽

（1.中央农业广播电视学校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

一种去除猪圆环病毒中支原体污染的方法

张雅会1，李少丽2*，李艳丽2

（1.中央农业广播电视学校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

针对目前病毒中普遍存在支原体污染的现状，本研究拟采用一种联合过滤和用Plasmocin两种方法，去除PCV2病毒中的支原体。PCV2病毒处理后，套式PCR检测处理病毒样品为阴性，同时进行IFA检测，其效价仍能达107.3TCID50/mL以上。结果表明，采用这种联合的方法在保证病毒效价不降低的情况下，彻底去除了PCV2病毒中污染的支原体，为同行关于去除病毒中污染的支原体提供了一种参考方法。

PCV2；支原体

在我国现阶段，疫苗免疫被认为是防控动物疫病的有效手段，这些疫苗中绝大部分为病毒类疫苗，病毒类疫苗的制备一般均需先分离病毒，而在采集病料分离病毒及病毒传代的过程中常因环境、使用器材污染等因素的影响，导致病毒被支原体污染。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5 μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态[1]，支原体约有1%可通过滤菌器。商品化的支原体抗生素Plasmocin主要用于治疗或预防细胞培养中支原体的污染，使用推荐浓度5倍的高浓度Plasmocin处理细胞，虽未观察到药物对细胞新陈代谢的副作用，但据检测，若在繁殖病毒的过程中，细胞培养液中反复加入Plasmocin，则会使病毒效价降低。

本研究以污染支原体的猪圆环病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）为例，研究出一种联合过滤和用抗生素两种途径去除病毒中支原体的方法。

1 材料

PCV2病毒由杭州荐量兽用生物制品实验室保存；胎牛血清购自Hyclone；MEM培养基购自GIBCO；Plasmocin购自Invivogen；0.1 μm滤菌器购自Milliple，细胞培养瓶、细胞培养板均购自Corning。

2 方法

2.10.1 μm滤器过滤PPCV2并连续繁殖四代用含5%胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度为2× 105个/mL。将PCV2用0.1 μm滤器过滤后，向MEM中接种PCV2，使PCV2接种量为MEM体积的1%，置于37℃、5%CO2培养箱，培养72 h。之后反复冻融3次，得到PCV2悬液。

以得到的病毒悬液为种毒，重复步骤2.1操作3次，得到第四代繁殖的病毒悬液。

2.2PCV2用终浓度2.5 μgg//mmLL的Plasmocin处理两代用含5%胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2×105个/mL，再向MEM中接种上述步骤中最终得到的PCV2，使PCV2接种量为MEM体积的1%，并向MEM中加入Plasmocin至终浓度2.5 μg/mL，置于37℃、5%CO2培养箱，培养72～96 h；细胞铺满后，将细胞瓶反复冻融3次，得到PCV2悬液；

重复步骤2.2操作1次，得到第六代繁殖的病毒悬液。

2.3常规繁殖PPCV2两代用含5%胎牛血清的MEM培养PK-15细胞，细胞密度2×105个/mL，再向MEM中接种步骤2.2最终制得的PCV2，使PCV2接种量为MEM体积的1%，置于37℃、5%CO2的培养箱，培养72 h；将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次冻融，得到细胞瓶中冻融好的PCV2悬液；

重复步骤2.3操作1次，即制得第八代所需的PCV2悬液。

2.4PCV2中支原体的检测参考猪支原体基因序列（Genbank，NR-103095.1），采用DNAMAN软件设计两对上下游引物：P1：AAGTCGTAACAACCTATCCCTA，P2：GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA；P3：GCAAGTCGATGAAGGACG，P4：GCTTCGCTCGCCACTACT，采用套式PCR法，以步骤2.3最终制得的PCV2为样品模板，并设灭菌双蒸水为阴性对照，猪滑液囊支原体为阳性对照，先用P1和P2引物进行PCR扩增，将其扩增产物作为PCR反应模板，再用P3和P4引物扩增目的基因片段。第2次PCR反应条件为94℃ 3 min，94℃1 min，56℃ 1 min，68℃ 1 min，共30 cycle，第2次PCR反应条件为94℃ 3 min，94℃ 1 min， 58℃ 30 s，68℃ 30 s，共30 cycle。PCR反应体系均为dNTP 4 μL，PCR Buffer 5 μL，P1和P2（P3和P4）均为1 μL，rTaq酶1 μL，模板1 μL，灭菌水37 μL，共50 μL体系。第2次PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测支原体。

2.5PCV2 TCID50的测定先将PK-15细胞用MEM稀释成2×105个/mL的细胞悬液，细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，再将步骤2.3最终制得的PCV2 10倍梯度稀释，选择10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6个梯度，每孔100 μL加到细胞悬液中，每个梯度重复6个孔，同时，设MEM培养液作阴性对照、107.3TCID50/mL的PCV2作阳性对照，阴性、阳性对照各1孔，然后将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中，培养72 h。

培养结束后，取出细胞培养板并弃掉细胞培养板中的液体，每孔加入100 μL冷的甲醇-丙酮固定液（甲醇和丙酮体积比1:1），-20℃固定30 min，弃固定液，再用pH 7.4的PBST洗涤1次细胞培养板后甩干。

将鼠源Cap蛋白单克隆抗体用PBS进行1:2 000倍稀释，100 μL/孔加入到甩干的细胞培养板中，将细胞培养板在37℃摇床孵育60 min，弃细胞培养板中液体，再用pH7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干。

将FITC-羊抗鼠二抗用PBS进行1:200倍稀释，100 μL/孔加入到甩干的细胞培养板中，锡箔纸包裹细胞培养板避光，将细胞培养板在37℃摇床孵育60 min，弃细胞培养板中液体，再用pH 7.4的PBST洗涤3次细胞培养板后甩干。

将甩干的细胞培养板于倒置荧光显微镜下观察，按Reed和Muench法计算PCV2效价。

3 结果

3.1PCV2中支原体的检测用滤菌器和Plasmocin处理过的PCV2 PCR检测不到支原体，而未处理的PCV2则检测出目的条带，阴性对照和阳性对照均成立，见图1。

3.2PCV2病毒TCID50的测定从各梯度的荧光效果看，用滤菌器和Plasmocin处理过的PCV2比未处理过的PCV2荧光强度好，且处理过的PCV2病毒效价仍能维持在107.3TCID50/mL以上（见图2，显微镜放大倍率为10×10）。

图1 PCV2支原体检测Fig.1 mycoplasma detection of PCV2

图2 PCV2的TCID50测定Fig.2 TCID50detection of PCV2

4 讨论

在细胞培养或在利用培养的细胞繁殖病毒的过程中，细胞或病毒被支原体污染是世界性的问题，支原体的污染来源常包括工作环境的污染、操作者本身的污染、试验器材的污染以及用污染支原体的细胞繁殖病毒。为获得无支原体污染的疫苗种毒或研究用病毒，以保证疫苗的纯净性和试验结果的可靠性，本试验联合0.1 μm的滤菌器和Plasmocin两种方法快速、彻底清除了PCV2中污染的支原体，且未影响到PCV2的病毒效价，为同行关于去除病毒中支原体的问题提供了一种参考方法。

Eliminate the mycoplasma in PCV2

Zhang Yahui1,Li Shaoli2*,Li Yanli2
(1.The central agricultural broadcasting and television school of tangshan branch,Hebei Tangshan 063000；2.Hangzhou Jianliang Veterinary Biological Preparations Co．Ltd,Zhejiang Hangzhou 310018)

Since the mycoplasma common contaminate in virus,To eliminate mycoplasma in PCV2, the research adopted a combined filtering and plasmocin two methods.PCR detection of PCV2 virus after processing,the results were negative,at the sametime detection of IFA,its titer can reached more than 107.3TCID50/mL.The results showed that the method using the joint in the case thoroughly eliminate the contaminated mycoplasma in PCV2 without lowing the titer of virus，and this case can provide a reference for peers about mycoplasma removal in virus.

PCV2;Mycoplasma

S852.62 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)08-0042-03

2016-06-28

张雅会（1984-），女，本科，兽医师，主要从事动物类产品监测研究。

李少丽（1983-），女，在职博士，兽医师，主要从事动物疫苗的开发与检测。