HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

曹明慧

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

曹明慧

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

应用高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗（HuN4-F112株）对28～30日龄的仔猪进行免疫，并定期采样检测，研究免疫后病毒血症持续时间和抗体消长规律，结果表明，病毒血症在免疫后第1周即可出现，最长可持续至免疫后第6周；疫苗免疫后，母源抗体明显下降，免疫后第3周平均阻断率最低为18%，此后开始上升，至免疫后第7周平均阻断率达到最高值85%，随后开始缓慢下降，至免疫后第16周时为54%。研究表明，HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后病毒血症持续时间最长为6周，抗体水平在免疫后第7周时达到最高。

仔猪；高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗（HuN4-F112株）；免疫；消长规律

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus）变异株引起的一种急性高致死性疫病[1]。发病主要特征为怀孕母猪流产、早产、木乃伊胎等，母猪流产率可达30%以上；仔猪出现严重的呼吸道症状，感染率可达100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前，我国使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗，据报道活疫苗免疫后可在动物体内复制并持续存在。为掌握高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后在猪体内的存在时间和抗体的消长规律进行了本试验。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 试验猪 在某猪场选择28～30日龄、未进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征免疫的健康仔猪15头，经荧光RT-PCR检测，猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、2型圆环病毒、猪伪狂犬均为阴性，试验猪编号为A1～A15。

1.1.2 疫苗 湖南株（HuN4-F112株）高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，政府招标采购。

1.1.3 RT-PCR试剂 鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）高致病性强毒和致弱HuN4-F112株疫苗毒的RT-PCR引物，由哈尔滨兽医研究所提供；dNTP、Primescript RT Enzyme mix、Oligo dT primer、Ex Taq聚合酶等购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒 购自北京天之泰生物科技有限公司，法国LSI公司生产。

1.1.5 核酸提取试剂 核酸提取试剂盒（磁珠法），购自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 试验器材 PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统，核酸提取仪，伯乐iMark酶标仪。

1.2方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗说明书提供的免疫剂量和注射部位对试验猪进行免疫注射。

1.2.2 采血 试验猪在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，连续采10周；以后每隔2周采血1次，连续采3次。分离血清，进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒（HuN4-F112株）核酸检测和抗体检测。

1.2.3 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）核酸检测

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列及第7列孔中分别加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后将板放入核酸提取仪中，按说明书程序进行自动化提取。

1.2.3.2 反转录 RNase-free dH2O 5 μL，5× Primescript buffer 2 μL，Primescript RT Enzyme mixⅠ0.5 μL，Oligo dT primer 0.5 μL，样品RNA 2 μL。混匀，37℃ 15 min，85℃ 5 s。1.2.3.3 PCR扩增 10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）3 μL，引物1、引物2、引物3（10 pmol/ μL）各0.5 μL，Ex Taq聚合酶0.25 μL，cDNA 2 μL，dH2O 11.25 μL。反应条件为95℃预变性5 min，94℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。

1.2.3.4 电泳 将PCR产物用浓度为1.5%的琼脂糖以5 V/cm电压进行凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察。扩增出1条约480 bp的特异性条带，则判为高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗毒(HuN4-F112株）核酸阳性；扩增出2条特异性条带（480 bp和340 bp）时，判为猪繁殖与呼吸综合征野毒核酸阳性。

1.2.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测 ①在ELISA板相应孔中加入50 μL阳性对照和阴性对照及200倍稀释的样品；②盖上膜，37℃作用60 min；③用300 μL洗液洗3遍，拍干；④每孔加入50 μL酶标抗体；⑤盖上膜，37℃作用60 min；⑥用300 μL洗液洗3遍，拍干；⑦加入50 μL底物，20～25℃作用10 min；⑧加入50 μL终止液，在450 nm下读数并计算结果。

2 结果与分析

2.1HuN4-F112株疫苗核酸检测结果免疫前疫苗毒核酸均为阴性。在免疫后1周时A2、A4、A5、A13号这4头猪疫苗毒核酸为阳性，免疫后2周时这4头猪变为阴性，而A6、A11、A12、A15号这4头猪的疫苗毒核酸为阳性。免疫后3周时阳性数最多，达到7头，阳性率为47%（7/15），其中有4头猪（A4、A6、A11、A22）在免疫后1周或2周时疫苗核酸已经为阳性。到免疫后4周时有5头阳性，阳性数开始下降，除A10号试验猪为首次检出阳性外，其余均为前期检出过阳性。至免疫后5周时没有阳性检出，到免疫后第6周时A6号猪又为阳性，从第7周开始再未检出阳性。在整个试验过程中，A1、A3、A8号猪未检测到疫苗毒核酸，见表1。

2.2猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果由于母源抗体的存在，免疫前抗体阻断率平均为82%，免疫后抗体水平开始下降，免疫后1周时下降至30%，免疫后2周时降至19%，至免疫后第3周降至最低，为18%。此后开始缓慢上升，至第4周升至为28%，到免疫后第5周时上升至67%，一直升至免疫后第7周85%这一最高水平后开始缓慢下降，至免疫后第16周时为54%。

表1 血清中HuN4-F112株疫苗毒核酸检测结果Table1 The NAT result of the HuN4-F112 strain in the experimental pigs serum

试验猪抗体的阳性率在免疫前也很高，为93%。免疫后阳性率开始下降，至免疫后第3周时阳性率只有33%，随后开始上升，至免疫后第5周时达到100%，此后一直在87%～100%之间，见表2。

2.3病毒血症与抗体水平的比较分析比较试验猪的病毒血症与平均抗体水平的变化规律可以发现，病毒血症的严重程度与抗体水平的高低呈负相关，即抗体水平低时，病毒血症就比较严重，随着抗体水平的不断上升，病毒血症逐渐减弱，当抗体维持在较高水平时，病毒血症消失。活疫苗免疫后被仔猪体内的母源抗体中和一部分，表现为母源抗体的迅速降低；剩余的疫苗刺激动物机体产生抗体，产生的抗体又不断的将活疫苗毒中和，表现为抗体一直处于较低水平；随着免疫时间的延长，抗体水平进一步提高，疫苗毒不断的被中和，以致无法被检测到，表现为病毒核酸检测结果为阴性[4]，见图1。

3 讨论与小结

PRRS流行病学非常复杂，猪繁殖与呼吸综合征

病毒（PRRSV）感染后可引起长期的持续性感染，猪场一旦污染该病毒后很难净化[5]。目前，临床上主要使用PRRSV灭活苗或弱毒苗进行免疫预防，虽然对该病的控制取得了一定成效，但仍然存在较多的问题。灭活苗免疫接种后，抗PRRSV特异性抗体产生的滴度低、速度慢，只能提供部分免疫保护[6]。弱毒苗免疫效果较好，但接种猪只后，疫苗毒会在猪只体内繁殖，并存在较长时间。研究结果表明，HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒在猪只免疫后1周即可从血清中检测到，病毒血症最长可持续到免疫后第6周。

表2 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果Table2 The antibody testing results of PRRSV

图1 病毒血症阳性率与平均抗体水平变化曲线Fig.1 The curves of viremia positive rate and average antibody levels

已经证明中和抗体在预防PRRSV感染和病毒清除中扮演重要角色[7]，临床上合理有效地利用疫苗来控制PRRS可以取得显著效果，能够减少病毒传播及病理损伤，改善生产性能及降低发病率和死亡率等[8]。PRRS弱毒疫苗由于诱导免疫反应的时间较长兼具体液免疫和细胞免疫，具有较强的免疫优势而得到广泛应用。疫苗免疫后的抗体产生时间及持续时间、免疫方式和时机等是影响PRRS活疫苗免疫效果的主要因素。本研究通过对免疫HuN4-F112株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗的猪群进行抗体检测，发现疫苗免疫后，仔猪的母源抗体会突然下降到较低水平，到免疫后第5周时免疫抗体才开始明显上升，至第7周时达到最高，随后开始缓慢下降。试验中发现，有些猪抗体水平呈波浪式上升或下降，这可能与疫病状况、生物安全水平、饲养管理水平等因素有关[9]。

目前，PRRS主要以持续性感染、亚临床感染、免疫抑制和继发细菌感染为流行特点，给临床防控带来困难。疫苗免疫作为防控PRRS的技术措施之一，不能完全清除病毒[10]。养殖场应定期开展免疫抗体检测，以此来判定疫苗的免疫效果，同时，也应加强生物防范措施和饲养管理来防控该病。

[1]屈满义.高致病性猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的研究[J].农业灾害研究，2011，1（1）：44-52.

[2]斯特劳B E，张中秋，赵德明，等.猪病学[M].北京：中国农业大学出版社，2003：205-230.

[3]WensvoortG,Terpstra C,PolJM.Mystery swine disease in The Netherlands:the isolation of Lelystad virus[J]. Veterinary Quarterly,1991.121-130.

[4]杨本勇，曹东，姜凤华，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）免疫后在血清中存在时间的报告[J].现代畜牧兽医，2014，9：1-4.

[5]夏平安，崔保安，张红英，等.特异性中和抗体终止猪体内猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制[J].中国兽医学报，2006，26（4）：354-356.

[6]Nilubol D,Platt K B,Halbur P G,et al.The effect of a killedporcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSVinfected pigs[J]. Vet Microbiol, 2004, 102(1-2):11-18.

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[10]李明波，宋忠旭，卢琴，等.猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的免疫与抗体监测分析[J].湖北农业科学，2015，54（21）：5359-5361.

The testing report of viremia and antibody levels changing rule after immunizing high pathogenicity PRRS attenuated vaccine(HuN4-F112 strain)

Cao Minghui
(China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081)

Immunize the piglets which were 28 to 30-days-old with the HuN4-F112 strain highly pathogenic PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome)attenuated vaccine,observed the viremia duration and the changing rule of antibody levels after immunization through regular sampling detection.The results showed that,viremia can appear in the first week and be surviving for six weeks at most after immunization.After vaccine immunization,the maternal antibody declined significantly,the average blocking rate is maximum 85%in the seventh week,it began to decline slowly later,and the average blocking rate is 54%in the sixteenth week.This research shows that viremia can be surviving six weeks at most with HuN4-F112 strain highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome attenuated vaccine,and antibody levels can reach the peak in the seventh week.

Piglet;HuN4-F112 strain highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome attenuated vaccine;Immunize;Rule of growth and decline

S852.65+9< class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)08-0037-05

2016-06-28

曹明慧（1991-），女，研究实习员，从事猪病研究工作。