布病实验室检测方法的筛选与应用

刘 佳，李 巍，陈明非，程淑晶，苍真伟，王德强，赵怡雯

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁 大连 116037）

布病实验室检测方法的筛选与应用

刘 佳1，2，李 巍1，2，陈明非1，2，程淑晶1，2，苍真伟1，2，王德强1，2，赵怡雯1，2

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁 大连 116037）

布鲁氏菌病一直危害着动物和人类的健康，更是影响到畜牧业发展和公共卫生等社会问题。一直以来，各界实验室都在寻求一种快速、准确的实验室检测方法来确诊布病。大连市兽医实验室共对大连26个乡镇12 900份羊血清进行检测，发现cELISA检测方法无论是特异性、重复性都优于其他血清学检测方法，更适合大连兽医实验室的应用和推广。

布鲁氏菌病；检测；cELISA

布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌属细菌引起的一种人畜共患病，猪、牛、羊都容易感染。世界动物卫生组织（OIE）将该病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。患病家畜可通过流产物、血液、精液、分泌物感染给人，布鲁氏菌病呈世界性分布，一年四季均可发病[1]，在国内羊为布病的主要传染源。近年来，羊布病感染病例呈逐年上升态势，不仅严重威胁人民群众身体健康，也给畜牧业生产带来巨大损失，直接影响到公共卫生安全和经济发展等问题。

布病的防控与净化已被列入《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》行列，是动物疫病监测工作的重中之重。而检测方法的选择是布病防控与净化的关键环节。目前布病净化采用传统的血清学检测方法有平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT），新型的血清学检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫胶体金试纸条检测[2]。

布病的检测方法虽然多样，但在布病的净化很难通过单一的血清学检测方法来定性确诊，一般都需要两种或两种以上的检测方法相结合来确诊病例。所以，选择简便、快捷、准确度高的检测方法对布病的防控和净化至关重要。2015年5～9月，大连市兽医实验室共对全市11个区市县26个乡镇12 900份羊血清进行检测，并对兽医实验室常用的布病净化的几种血清学检测方法进行比对、评估，为日后布病净化血清学检测方法的选择提供了指导。

1 材料与方法

1.1材料待检羊血清样品，采自大连11个区市县26个乡镇羊场和散户，共计12 900份。

1.2试剂虎红平板凝集抗原，中国兽药监察所生产，批号：201503；试管凝集试验抗原，中国兽药监察所生产，批号：201403；布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒，哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司生产，批号20150826；布鲁氏菌抗体检测试剂盒，美国IDEXX公司生产，批号：PO4130-25023；羊布病胶体金试纸条，韩国安捷动物诊断试剂有限公司生产，批号：T2306020。

1.3仪器准备离心机，洗板机，生化培养箱，单、多道移液器。

1.4检测方法与判定标准虎红平板凝集试验（RBPT）与试管凝集试验（SAT）是按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2002）进行检测；布鲁氏菌cELISA抗体检测试验、布鲁氏菌iELISA抗体检测试验及胶体金试纸条检测是严格按照试剂使用操作说明书进行操作。判定标准按国家《布鲁氏菌病防治技术规范》执行。

2 样品检测

首先用虎红平板凝集试验（RBPT）对12 900份羊血清进行筛查，对筛查结果阳性样品再采用试管凝集试验（SAT）、cELISA抗体检测试验、布鲁氏菌iELISA抗体检测试验和胶体金试纸条进行检测比对，检测结果见表1。

表1 不同试验方法检测结果Table1 Results of different test methods

3 检测结果分析

由表1可以看出，RBPT共检测出布病阳性样品173份，对173份阳性样品用其他4种方法检测，结果显示，SAT的阳性检出率为63%；iELISA的阳性检出率为79%；cELISA的阳性检出率为81%；胶体金试纸条的阳性检出率为92%。

根据判定标准要求，RBPT阳性，SAT阳性可以判定为抗体阳性个体，RBPT阳性但SAT阴性需要间隔30 d后重新采样再进行检测。本实验室对RBPT阳性但SAT阴性的64只羊经重新采样，用RBPT方法检测，检测结果见表2。

表2 重新采样后RBPT检测结果Table2 RBPT results after re-sampling

根据试验数据显示，重新采样的RBPT阳性数为31份，表1的SAT阳性数为109份，两次检测共检测阳性数为140份。将以上几种试验方法和检测阳性数进行统计分析，确定每种试验方法的符合率、特异性和敏感性，结果如图1所示。

图1 不同检测方法符合率、特异性和敏感性的比较Fig.1 Comparison of different methods in recombination rate,specificity and sensitivity

4 讨论

4.1 随着乳、肉及其制品、皮、毛等产业的迅速发展，布鲁氏菌的防治工作显得尤为重要，检测布鲁氏菌的血清学诊断方法种类繁多，但总的说来目前还没有任何一种方法在敏感性、特异性及可操作性等方面都能令人满意[3]。因此，在实际检测工作中，常需要两种或两种以上的检测方法相互配合。采用虎红平板凝集试验（RBPT）和试管凝集试验（SAT）都需要采血，工作量不仅很大，更是增加了工作难度。其次，尽管SAT是常用的布氏杆菌病诊断方法，但是此法操作繁杂、费时，主观影响因素较大，并且不适于现场应用[4]；RBPT和胶体金试纸条虽然操作简单，反应时间较短，成本也相对低廉，但试验易受温度的影响，特异性和敏感性都差一些，经常会有假阳性的情况出现，很难准确判定结果，更适合布病的普筛和初筛。

4.2 通过检测结果分析发现，不同检测方法的检测结果是不完全一致的，阳性样品的符合率也不完全一致。例如，RBPT检出的阳性数为173份，胶体金试纸条检出的阳性数为159份，SAT检出的阳性数是109份，而实际检出的阳性数是140份，说明PBRT和胶体金试纸条两种检测方法存在假阳性的可能性，而SAT则存在假阴性的可能性。

4.3 通过试验结果分析发现，ELISA方法检出的阳性样本的准确率最高，均达到了95%以上，尤其是cELISA方法，特异性、敏感性、符合率均达到了100%。ELISA方法的特点是操作简便、快速、特异性好、准确度高，可进行大量样品检测[5]。早期，Garin-Bastuji等[6]首次用ELISA来检测布鲁氏菌抗体表明ELISA的检测方法的敏感性要比试管高出十倍以上，石琴等[7]也指出cELISA比iELISA特异性更高，可以消除部分由细菌交叉反应引起的非特异性反应，并可以排除绝大多数牛种布鲁氏菌19株免疫接种产生的残留抗体的反应。cELISA相比iELISA无论是特异性、符合率都要更好一些，适合于兽医实验室对布病检测的应用与推广。

[1]万遂如.目前奶牛主要疫病流行状况与防控技术（下）[J].现代畜牧兽医，2015，（6）：54-57.

[2]张彦婷，刘艳琴，赵林立，等.布鲁氏菌检测技术的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2008，29（6）：43-46.

[3]臧鹏伟，张振岚，范万东，等.全乳环状试验检测奶牛布氏杆菌病的试验探讨[J].畜牧与兽医，2002，34（6）：28-29.

[4]赵凤菊，李璐，闫明媚，等.牛、羊布鲁氏菌病试管凝集试验与微量凝集试验检测方法的比较[J].现代畜牧兽医，2015，（2）：8-10.

[5]姚伟，兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点[J].现代畜牧兽医，2015，（2）：36-38.

[6] Garin-Bastuji B, Blasco, Grayon M, et a1. Brueella melitensis infection in sheep:present and future[J]. Vet Res, 1998, 29(3-4): 255-274．

[7]石琴，袁立岗，梁俊明，等.兽医实验室实用布鲁氏菌检测方法[J].新疆畜牧业，2013，5：18-19.

Screening and application of laboratory testing method onbrucellosis detection

Liu Jia1,2,Li Wei1,2,Chen Mingfei1,2,Cheng Shujing1,2, Cang Zhenwei1,2,Wang Deqiang1,2,Zhao Yiwen1,2
(1.DaLian Center for Animal Disease Prevention and Control,Liaoning Dalian 116037; 2.DaLian Animal Husbandry Station,Liaoning Dalian 116037)

Brucellosis not only has endangered animal and human health,but also has affected the development of animal husbandry and public health and other social issues.All the laboratories are looking for a fast and accurate laboratory tests method to confirm the diagnosis of brucellosis.12 900 goat serum in 26 towns in Dalian have been tested by Dalian Veterinary Laboratories.It shows that cELISA is better than other serological methods in specific detection and repeatability.cELISAis more suitable for application and promotionby veterinary laboratories in Dalian.

Brucellosis；Detection；cELISA

R516.7 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)08-0010-03

2016-07-11

刘佳（1985-），女，硕士研究生，硕士，兽医师，研究方向为动物疫病诊断及防控。