拉曼光谱液体样品检测过程的标准化设计与影响因素分析

张人 / 复旦大学分析测试中心

拉曼光谱液体样品检测过程的标准化设计与影响因素分析

张人 / 复旦大学分析测试中心

介绍了拉曼光谱液体样品毛细管检测法，研究了毛细管的管径以及毛细管内不同空间位置对于信号强度的影响，明确了获得最优信号强度的空间位置，并给出了标准化检测步骤。实验结果的统计分析验证了毛细管法能够获取具有高重复性的实验结果。

拉曼光谱；液体样品；毛细管；标准化检测

0 引言

拉曼光谱是一种基于分子极化率变化的分子振动光谱，具有无损、高灵敏度、高分辨率、可在线检测等优点，被越来越广泛应用到包括医药、化工、公共安全、新材料及纳米科技等各个行业。拉曼光谱不需制样便可检测包括水溶液的液体样品，可定性及定量地提供相关溶液所包含的溶质及溶剂的物质种类信息。JY/T 002-1996《激光喇曼光谱分析方法通则》及正在修订的《激光拉曼光谱分析方法通则》征求意见稿提出了液体样品检测的指导意见，包括使用毛细管样品检测法。然而因市售毛细管种类众多，且上述指导意见未明确标准化操作，因此在实际检测过程中因毛细管规格的不同造成对样品检测结果的不一致。本文通过研究拉曼光谱液体样品毛细管检测法中多种毛细管因素对实验结果的影响，提出了一种标准化检测流程。

1 测量系统的构成

液体样品的拉曼光谱毛细管检测系统由拉曼光谱仪的显微系统（物镜）和毛细管构成，如图1（A）所示。整个系统置于减震平台上，毛细管置于固定装置后固定于显微镜下。若液体为易挥发样品或易于流动，需封闭毛细管的两个端口。将毛细管放置于显微物镜下，通过物镜的观察调节物镜台，将物镜焦点置于液体内部。通过拉曼光谱仪控制软件，设定激光波长、检测范围和扫描时间等参数，并控制拉曼光谱信号的采集。图1（B）为毛细管内部空间示意图，中间的三角锥代表入射激光，同时将毛细管内与入射光平行的方向(y)计为垂直径向方向，与入射光垂直的方向(x)计为平行轴向方向。

图1 (A)显微拉曼光谱仪毛细管检测系统；(B) 毛细管内部空间示意图

本文所用拉曼光谱仪型号为Horiba Jobin Yvon公司的XploRA，激光波长选为785 nm，测量光谱范围设定为200-1 800 cm-1，信号采集方式为180°背散射检测。被检测物品为国药集团生产的分析纯无水乙醇，并以拉曼散射位置在875.8 cm-1的C-C-O骨架伸缩振动峰用作记录信号强度的标记峰[1]。

2 方法依据与方法分析

拉曼光谱液体样品毛细管检测法，因毛细管在使用过程中便捷，所需样品量少（一至几十微升），对检测时间无要求（暴露环境中的液体因不断挥发，会导致检测时间短且不稳定），可以再次回收样品等特点，使其成为实际检测操作的首选方法。但在样品检测过程中，因拉曼光谱仪的共焦设计[2]提供信号的空间约为直径10 μm、长度数十微米的圆柱状[3]，而毛细管的直径有数百微米至毫米数种规格，且毛细管管壁对入射激光具有散射作用而影响入射光强，故需考察毛细管的管径与毛细管内部的空间布局对信号强度的影响，以明确不同检测条件下所测结果的可比性。

根据上述要求，如果将激光焦点移动定位至毛细管管径截面圆心，因激光焦点距离管壁最远，受管壁影响最小，且能够获得整个检测空间的信号，故可以获得最强的散射信号。实际操作中可以发现，当处于截面圆心位置时，恰好能够在物镜中观察到如图2（A）所示的清晰毛细管内径侧壁的像，故可以利用该聚焦位置进行检测标准化设计。基于上述理论设想与操作特点，本文以毛细管截面圆心位置为出发点，比较周围空间的拉曼散射信号的强度变化情况，进而对JY/T 002-1996《激光喇曼光谱分析方法通则》及正在修订的《激光拉曼光谱分析方法通则》征求意见稿中的推荐方法进行标准化操作探讨。

2.1 测量步骤

1）用毛细管吸取被检测溶液；

2）将毛细管置于毛细管架上；

3）将毛细管置于拉曼光谱仪的物镜下；

4）调节样品平台位置，将毛细管准确定位于物镜焦点下方；

5）调节样品平台高度，将物镜焦点推至毛细管内部；

6）精细调节样品台的位置与高度，使得物镜视野内能清晰观察到如图2（A）所示的毛细管内径侧壁像，且将焦点位置移至内镜像的中心位置；

7）在拉曼光谱仪中设定好检测范围、扫描时间和激光波长等参数后开始检测，获取如图2（B）所示的拉曼散射信号（被标记处信号峰为C-C-O骨架伸缩振动，用于记录散射信号）。

图2 (A)显微镜下观察到的毛细管内径成像；(B)无水乙醇的拉曼散射光谱图

2.2 管径的影响

为了研究不同直径的毛细管对于拉曼信号强度的影响，本文选取了5种毛细管（如图3（A）所示），管径均值分别为0.3 mm、0.5 mm、1 mm、1.8 mm和5 mm（5 mm管为核磁管，已无毛细效应，用于比较管径的影响）。在吸取适量的无水乙醇后，按本文2.1的测量步骤进行信号采集，信号强度与管径关系如图3（B）所示。从图3（B）中可以看到，随着管径的增大信号逐渐增强，当管径为1.8 mm时信号最强，增大至5 mm时信号略下降，其原因可能在于激光光柱受小管径毛细管管壁的散射要大于大直径毛细管管壁的散射，从而使得照射在采样区的激光强度下降，导致信号随管径的减小而下降。

2.3 毛细管水平径向位置的影响

拉曼光谱采样信号界面大约为数微米，因而需考虑毛细管水平径向方向（图1（B）中x轴）是否对强度也有明显影响。为了考察该问题，如图4（A）所示，对直径为1 mm的毛细管该方向进行超过30个点的扫描，并将强度记录成随水平径向分布的图形如图4（B）所示。从图4（B）中可以看到，在水平径向中心位置（横坐标0点即毛细管横截面圆心位置处）至两侧一定范围内的强度基本保持稳定，但在超出该范围后强度迅速下降。该结果表明，在毛细管水平径向位置中线上是强度最高的点，同时在一定水平位置空间内能够保持信号稳定。

为了进一步考察不同管径的毛细管在水平径向位置上的信号强度分布情况，5种不同管径的毛细管吸取无水乙醇后进行了跨度为6 mm（-3～3 mm）的水平扫描，结果如图5所示。从图中可以看到，管径越大，所能提供的水平径向检测空间越宽，管径5 mm的毛细管比管径1 mm的检测空间宽大约4倍，比0.3 mm的大约7倍。其原因可解释为管径越大截面圆心离管壁越远，故检测空间越大。但需要指出的是，当管径增大时，一方面毛细管效应下降，另一方面样品需求量上升明显，所以在实际使用中需要综合考虑所用毛细管的规格。

图3 (A)不同管径的毛细管；(B)不同毛细管管径系统下测得的乙醇信号强度

图4 水平径向方向的强度分布(A)毛细管内径图；(B)水平径向方向上的检测强度分布

图5 不同毛细管管径系统下的水平径向检测范围

图6 径向垂直方向的强度分布

2.4 毛细管纵轴径向位置的影响

由于毛细管纵轴径向方向（图1（B）中y轴）与激光入射方向重叠，且激光的采样空间在纵轴方向的分布更广（约数十至数百微米）[3]，故拉曼信号强度可能对纵轴方向的空间变化更敏感。根据上述推测，沿纵轴径向不同位置进行采样，将所得信号强度与其所处位置作图，如图6所示。从图6中可以看到，确如预期纵轴径向随离圆心位置有明显的信号强度衰减，其信号衰减速度大于水平径向位置上的衰减速度，在偏离中心位置100 μm处便出现了明显的信号下降，说明在纵轴径向位置更需要标准化操作设计，即将观察到明确的毛细管内径管壁像时才能确认激光焦点聚焦于毛细管截面中心，进而获取最优的拉曼光谱信号。

3 统计分析

明确激光焦点位置聚焦在毛细管界面圆心位置能获取最优的拉曼光谱信号后，尚需考察毛细管检测系统的检测重复性。在保持相同的实验条件下，本文对拉曼光谱的强度进行了51次重复测试，相关统计结果如表1所示。从表1中可以看到，51次测量的相对标准偏差为2.08%，从之前的实验结果来看，该结果可能与毛细管的品质直接相关。若能够提升毛细管的品质，如管径和管壁厚度的均一度，或能进一步降低相对标准偏差，从而使得毛细管检测体系能够更加准确地应用于定量检测。

表1 同一规格的毛细管多次采样的统计数据

4 结语

本文就JY/T 002-1996及正在修订的《激光拉曼光谱分析方法通则》征求意见稿中所推荐的拉曼光谱液体样品毛细管检测法进行了检测操作标准化设计，研究了相关毛细管参数及仪器检测参数对检测结果的影响，并依据统计数据分析了该标准化操作下的实验误差。实验结果表明，拉曼光谱液体样品毛细管检测法能够稳定有效地提供被测样品的拉曼光谱信号，但需要对指导方法补充的是在检测过程中对检测空间进行标准化的选取，即在光学成像辅助下使激光焦点聚焦到毛细管的截面圆心位置，才能获得高稳定性、高重复性、高强度的拉曼光谱信号，从而使拉曼光谱液体样品毛细管检测法更好地适用于各个应用领域。

[1]F R 多林希.有机化合物的特征拉曼频率[M].北京：中国化学学会，1980.

[2]杨序纲.拉曼光谱的分析与应用[M].北京：国防工业出版社，2008.

[3]R Tabaksblat，R J Meier and B J Kip.Confocal raman microspectroscopy - theory and application to thin polymer sample[J].Applied Spectroscopy，1992（46）：60-68.

Standardized design of liquid sample testing process based on Raman spectra and its influencing factors

Zhang Ren
（Analysis and testing center of Fudan University）

This paper introduces the capillary testing method of liquid samples based on Raman spectra, investigates the influence of capillary diameter and different spatial position within the capillary on signal intensity, definds the spatial position to achieve the optimized signal intensity and the standardized testing process.Following the process, testing experiments are carried out.Statistics analysis results of the experiments show that the capillary method could obtain a good testing repeatability.

Raman spectra; liquid sample; capillary; standardized test