CT引导下穿刺活检检测EGFR、ALK基因临床价值分析

胡晓菲 汪俊 王钢胜

CT引导下穿刺活检检测EGFR、ALK基因临床价值分析

胡晓菲 汪俊 王钢胜

目的 探讨CT引导下肺癌穿刺活检表皮生长因子受体(EGFR)、间变淋巴瘤激酶(ALK)基因检出率及阳性率，并对其临床应用价值进行分析。方法选取临床确诊的肺癌患者280例，保留CT引导下穿刺活检标本，分为2组：观察组(n=200,应用粗针穿刺)和对照组(n=80,应用细针穿刺)，2组对临床病理特征与基因突变相关性、阳性率、检出率、肿瘤细胞数量及术后并发症情况比较。结果女性患者EGFR基因突变率为66.04%，男性基因突变患者28.74%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，非吸烟患者EGFR基因突变率为57.24%，吸烟患者29.63%，差异有统计学意义(P<0.05)；年龄、病理学分期EGFR基因突变率区别差异无统计学意义(P>0.05)。腺癌患者EGFR基因突变率显著高于其他类型肺癌(P<0.05)；ALK基因表达在不同性别、年龄、病理学分化程度，差异无统计学意义(P>0.05)。其Ⅳ期患者ALK基因突变率较其他期患者高，差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR、ALK基因检出率、阳性率比较，观察组较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)，观察组检测出平均肿瘤细胞个数多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组并发症总发生率高于观察组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论EGFR、ALK基因粗针检出率高于细针检出率，但细针检出率仍有一定临床诊断意义，且并发症发生发生率低于粗针，可以根据患者实际情况进行选择不同的针型，均具有一定的临床诊断价值。

肺癌；基因突变；活检；表皮生长因子受体；间变淋巴瘤激酶

肺癌在我国的发病率居高不下，近年来更呈现出明显的上升趋势[1]。其中80%以上的肺癌发病类型为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)，其主要包括腺癌、鳞癌等，腺癌是其中较为常见的病理组织类型，患者确诊时多已出现远处转移病灶，晚期患者5年生存率只有15%[2]。通过对NSCLC相关驱动基因的深入研究、分子靶向治疗研究的不断深入，人们发现靶向药物治疗的临床效果显著。目前的针对性治疗的分子靶向药物多为酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKIs)及克唑替尼(crizotinib)，其主要作用于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)，临床效果优异[3]。临床上应用CT引导下经皮肺穿刺活检术用于诊断肺部疾病已经十分常见。常用的有细针穿刺、粗针穿刺活检术，由于该术式为创伤性辅助检查，临床上并发症发生率较高，而从实用角度来讲，针对何种情况下使用临床并发症较小的细针穿刺术式成为临床诊断关注的重点。本研究旨在对NSCLC患者行CT引导下检测EGFR与ALK基因突变与临床病理表现之间的内在关系及粗/细针穿刺活检的临床应用价值进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2015年2月于鄂东医疗集团黄石市中心医院临床确诊的肺癌患者280例，保留CT引导下穿刺活检标本。对照组(n=80)采用CT引导下的细针穿刺活检术，其中男44例，女36例；年龄22～72岁，平均年龄(58.1±7.8)岁，中位年龄59岁。观察组(n=200)采用同样CT引导下粗针穿刺活检术，其中男130例，女70例；年龄28～80岁，平均年龄(60.2±8.2)岁，中位年龄60岁。所有纳入研究患者术前未进行放化疗及靶向治疗，且知情同意进行临床研究。

1.2 穿刺方法 对照组使用Cook 19G型同轴活检针进行穿刺，观察组使用BioPince 17G全自动活检针行活检穿刺术。2组穿刺所获得的肿瘤长度在1 cm左右，能够满足实验室诊断要求。

1.3 检测方法 EGFR基因突变检测采用ARMS方法对CT引导下穿刺活检标本进行：样本HE切片后经经验丰富的病理科医生选择合适的基因检测的区域做成石蜡切片10～15张，层厚控制在5 μm左右，并用二甲苯对样本进行脱蜡处理，经无水乙醇液浸泡后冲洗烘干备用，随后离心提取样本DNA。采用EGFR检测试剂盒(厦门爱德生物医药科技有限公司生产)检测18～21外显子突变情况。将提取后的DNA稀释，加入2.25 μl Taq酶，摇匀后离心，加入PCR试管，设置参数为：1个循环95℃、5 min，15个循环95℃、25 s，64℃、20 s，72℃、20 s；再重复15个循环后手机FAM、HEX信号； ALK融合基因采用VENTANA ALK(D5F3)免疫组化方法进行检测，分析肿瘤细胞数量，计数采集100个完整细胞，其中出现15个以上异常细胞即为阳性。

1.4 结果判读 在检测前通过普通光镜对标本HE切片肿瘤细胞数量、有核细胞数量进行计数。所有数值判读均由两位病理科医生独立判读记录，对结果不一致的样本进行协商或由第三方进行判读。

2 结果

2.1 2组基因突变情况与病理特点关系比较 女性患者EGFR基因突变率为66.04%显著高于男性基因突变患者28.74%，差异有统计学意义(P<0.05)，非吸烟患者EGFR基因突变率为57.24%明显高于吸烟患者29.63%，差异有统计学意义(P<0.05)；年龄、分期基因突变率区别差异无统计学意义(P>0.05)。组织学类型比较可以看出腺癌患者EGFR基因突变率显著高于其他类型肺癌(P<0.05)；ALK基因表达与性别、年龄、病理学分化程度无显著相关性，差异无统计学意义(P>0.05)。18例ALK基因突变腺癌患者均未吸烟，Ⅳ期患者ALK基因突变率较其他期患者高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组EGFR、ALK基因突变与病理关系比较 例

2.2 2组阳性检出情况比较 CT引导下穿刺活检EGFR基因，观察组(45.50%)较对照组(25.00%)检出率高，差异有统计学意义(P<0.05)，阳性检出率分别为6.25%、21.00%，观察组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组检测出肿瘤细胞平均为(52.64±24.23)个，高于对照组(37.66±14.43)个，差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR及ALK基因检测阳性率观察组均占优(P<0.05)。见表2、3。

表3 2组活检阳性率比较 例(%)

2.3 2组患者术后并发症发生情况比较 观察组气胸20例(10.00%)、渗血29例(14.50)、咯血10例(5.00%)而对照组为气胸3例(3.75%)、2例渗血(2.50%)，无咯血病例，2组并发症总发生数比较，细针穿刺活检术优于粗针，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组并发症发生情况比较 例(%)

3 讨论

NSCLC患者中EGFR基因突变率一般为50%左右，且主要发生突变的人群以亚裔血统、女性、无吸烟史、腺癌患者居多。大量研究报道，表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶受体的一种，在多数的NSCLC患者中表达上调，能够作为治疗NSCLC的一个重要靶点[4-8]。其靶点作用药物酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能够有效提高晚期NLCLC患者临床治疗效果并提高患者生存时间，临床有效率可达70%～80%，无进展生存期可以达到9个月～1年，但其生物活性常具有一定的局限性，患者在20号外显子、K-Ras突变或c-Met基因扩增都会导致耐药性的产生[9]。

现代研究证实，NSCLC中ALK基因可能发生重排现象，单纯ALK 基因重排发生率可达3%以上[10]。ALK基因突变患者于EGFR突变患者病理特征相近，临床上常用克唑替尼作为针对性治疗药物，对于单纯ALK基因重排患者，其药物有效率可以达50%以上。

CT引导下的经皮肺穿刺活检术，具有创口较小、操作简洁、并发症发生率低等特点，现已作为临床上组织活检的重要应用术式之一。通过肺部穿刺活检，能够针对临床晚期NSCLC患者进行有效诊断，在获取一定的生物标本后能够进一步对基因突变类型进行研究，为下一步靶向药物治疗提供依据。与开放性手术取样比较，穿刺活检术的局限性表现在活检标本中有效研究细胞数目相对含量低、数目少，因此研究合适的穿刺针型、合适的活检方法能够为提高检出阳性率提供一定依据。本研究中，2组患者CT引导下的穿刺活检术均取得了较为满意的效果。

从研究结果可以看出，EGFR基因突变与临床病理特征的较强的相关性。临床研究中，常用的基因突变检测方法有DNA测序、ARMS、PCR-SSCP、mutant-enriched PCR、CE-LIF等，其中探针扩增阻滞突变系统(ARMS)是将ARMS与Scorpions相结合的高校检测EGFR突变的技术。已有相关研究将该方法应用于NSCLC患者EGFR突变检测，其总检出率可在50%左右[11，12]。本研究中，共检测到120例患者有EGFR突变基因表达，其突变率能够达到42.86%；相关资料表明，不同种族、生活方式的突变率相差较大，其中有亚裔血统的患者突变率较欧美人种高出20%，而当中中国人群NSCLC患者EGFR突变率相对值更高[13]。研究结果显示，EGFR基因突变率女性患者明显高于男性患者(25.00%，17.86%，χ2=35.92，P<0.05)；非吸烟患者突变率显著高于吸烟患者(28.57%，14.29%，χ2=17.60，P<0.05)；腺癌基因突变率(37.50%，χ2=46.37，P<0.05)显著高于其他组织学类型肺癌。而研究中EGFR基因突变率变化与患者年龄及病理分期无显著相关性，差异无统计学意义(P>0.05)，所得结论与国内外研究结果相近[14]。

ALK是一种受体类酪氨酸激酶，属胰岛素受体族系，在NSCLC中，ALK重排发生率为3%～7%，部分研究证实，EML4-ALK融合基因与EGFR相似均为NSCLC驱动基因之一[15]。本研究中，18例ALK基因阳性患者均无吸烟史且组织学分型均为腺癌。且没有发现ALK基因表达与性别、年龄、分化类型呈相关性(P>0.05)，可以考虑与ALK基因表达阳性检出者较少有关。研究发现，无吸烟史患者较吸烟患者ALK基因表达率高，差异有统计学意义(χ2=12.62，P<0.05)，Ⅳ期患者突变率较非Ⅳ期患者显著升高(χ2=21.68，P<0.05)，其主要与晚期患者无法进行手术治疗，活检穿刺为其病理检查首选相关。

研究结果显示，观察组EGFR、ALK基因突变检出率高于对照组(χ2=11.77、28.46，P<0.05)，阳性率比较观察组亦占优(χ2=9.20、7.88，P<0.05)，观察组检出率高可能与检出平均肿瘤细胞数量较对照组多有关。2组术后并发症发生情况比较可以看出，观察组并发症总发生率为29.50%，对照组并发症总发生率为6.25%。细针穿刺活检术优于粗针，其差异均有统计学意义(χ2=16.22，P<0.05)。

从研究所得数据可以看出，EGFR基因及ALK基因检出率相比，粗针活检穿刺检出率高于细针，但细针仍有一定的病理学诊断作用，对于晚期NSCLC患者，如创伤面较大可能会影响预后，因此CT引导下细针穿刺活检仍有一定的适用范围。

综上所述，在实际临床病理学诊断中，行CT引导下穿刺活检术，常规角度来讲，粗针活检检测阳性检出率较高，但并发症发生率较高，而细针虽然有一定的局限性，但操作过程中注意进针方向、实施多点穿刺，在足够病理学标本的基础上，提高肿瘤细胞包含量，可以增加基因检测的准确性，具有一定的临床应用价值。

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Clinical significance of detection of EGFR and ALK genes by CT guided puncture biopsy

HUXiaofei*,WANGJun,WANGGangsheng*.

*CentralHospitalofE’dongMedicalGroup,AffiliatedHospitalofHubeiCollegeofScienceandEngineering,Hubei,Huangshi435000,China

Objective To observe the detection rate and positive rate of epidermal growth factor receptor (EGFR) and anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene by lung cancer puncture biopsy under CT guidance, and to analyze its clinical application value.Methods Two hundred and eighty specimens from the patients with lung cancer who were treated in our hospital from January 2013 to February 2015 were taken by CT guided puncture biopsy,which were divided into two groups:observation group (n=200,thick needle puncture) and control group (n=80,thin needle puncture).The clinicopathological characteristics, gene mutation correlation,positive rate, detection rate,tumor cell number and postoperative complications were observed and compared between two groups. Results The gene mutation rate of EGFR in female patients was 66.04%,however, which was 28.74% in male patients,there was a significant difference between two groups (P<0.05). Moreover there was a significant difference in gene mutation rate of EGFR between non-smoking patients and smoking patients (57.24% vs 29.63%,P<0.05).However there were no significant differences in patien’s age,pathological staging,gene mutation rate of EGFR between two groups (P>0.05).The gene mutation rate of EGFR in patients with lung adenocarcinoma was significantly higher than that in the patients with the other types of lung carcinomas (P<0.05). There were no significant differences in the expression levels of ALK among different sex and age, pathological differentiation degree (P>0.05), in which the gene mutation rate of ALK in patients at stage Ⅳ was significantly higher than that in the patients at the other stages (P<0.05). The detection rate and positive rate of EGFR,ALK in observation group were significantly higher than those in control group (P<0.05).The average tumor cell numbers detected in observation group were much more than those in control group (P<0.05).Besides the total incidence rates of postoperative complications in observation group were significantly higher than those in control group (P<0.05).Conclusion The detection rates of EGFR,ALK gene by thick needle puncture biopsy are higher than those by thin needle puncture biopsy, however, thin needle puncture biopsy has still certain clinical significance, moreover,the incidence rates of postoperative complications in thin needle puncture biopsy are lower than those in thick needle puncture biopsy,thus, both detection methods have certain clinical diagnostic value.

lung cancer;gene mutation; biopsy;epidermal growth factor receptor;anaplastic lymphoma kinase

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.004

项目来源：湖北省卫生和计划生育委员会(编号：WJ2015MB278)

435000 湖北省黄石市，鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)肿瘤内科(胡晓菲、王钢胜)；武汉科技大学附属汉阳医院妇科(汪俊)

汪俊，435000 武汉市，武汉科技大学附属汉阳医院妇科；

E-mail：451818725@qq.com

R 734.2

A

1002-7386(2016)24-3700-04

2016-07-13)