樟子松组培苗菌根化技术研究*

张文泉，罗国涛，邓洁

(凯里学院，贵州 凯里 556011)

樟子松组培苗菌根化技术研究*

张文泉，罗国涛，邓洁

(凯里学院，贵州 凯里 556011)

樟子松是我国西北干旱地区的主要造林树种。为了获得樟子松菌根化组培幼苗，以樟子松成熟胚为外植体，通过愈伤途径获得樟子松组培幼苗，接种厚环乳牛肝菌与点柄乳牛肝菌两种不同的菌种，进行菌根合成试验。结果表明，接种厚环乳牛肝菌后樟子松组培苗各项生长指标均显著提高。试验结果将为樟子松组培苗菌根化技术提供依据。

樟子松；厚环乳牛肝菌;点柄乳牛肝菌;组培苗；菌根化

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.)是松科(Pinaceae)松属(Pinus)高大常绿乔木树种，是欧洲赤松的一个地理变种，其材质良好，防风固沙作用显著，且抗寒、抗旱、耐贫瘠、适应性强且较速生，是中国西北地区造林及防风固沙的主要树种。但樟子松结实间隔期长，籽粒空瘪率高，有性繁殖难以满足生产上对苗木的需要[1～2]，组织培养能为樟子松的快繁提供一条有效的途径。但通过组培获得再生植株的过程是在无菌条件下进行的，所以组培苗不存在与菌根真菌接触的机会，导致苗木生长状况较差，抵抗力较弱，成活率较低。因此，尽早对组培苗进行高效菌根真菌的人工接种，实现其菌根化，是培育壮苗的重要途径之一[3]。

厚环乳牛肝菌(SuillusgrevilleiSing.)与点柄乳牛肝菌(SuillusgranulatusO.Kurttee)二者均属于担子菌亚门(Basidiomycotina)牛肝菌科(Boletaceae)粘盖牛肝菌属(Suillus)，是自然界最为常见的外生菌根真菌，其具有突出的抗旱性和抗贫瘠能力，在含水量低的土壤中及在各种恶劣生境条件下常成为优势种群[4～8]。有研究者对内蒙古外生菌根资源与生态调查发现，松科树种与牛肝菌共生现象普遍，在极其恶劣的生态环境和不断退化的生态系统中，樟子松能够生长良好，可能与菌根共生有重要的关系[9]。目前国内外对樟子松实生苗进行菌根合成试验报道的很少，而对樟子松组培苗进行合成试验的研究尚属空白。

因此，本文对樟子松组培苗进行厚环乳牛肝菌、点柄乳牛肝菌的菌根化研究，试图探明樟子松与厚环乳牛肝菌、点柄乳牛肝菌之间的菌根关系，以期为樟子松的培育壮苗以及植被建设提供新的理论及试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试种子采自内蒙古自治区呼伦贝尔市鄂温克族自治旗红花尔基樟子松国家森林公园。

供试菌根真菌 厚环乳牛肝菌(标记为G-S.g)，点柄乳牛肝菌(标记为S.g)，由樟子松菌根组织分离得到。菌根采集地为红花尔基樟子松国家森林公园，已完成分子生物学鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 组培苗的获取

以樟子松成熟胚为外植体，采用MS+1.5mg/L 2，4-D +0.5mg/L 6-BA培养基诱导愈伤组织；以MS+0.2mg/L IAA+1.5mg/L 6-BA为愈伤组织分化培养基诱导不定芽，在1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培养基上诱导生根，获得完整植株，组培苗出瓶后炼苗6个月，栽培1个月后按株型大小均匀搭配，留待接种。

1.2.2 供试固体菌剂的培养

将MMN营养液与蛭石混匀(含水量60%)，装袋，高温高压灭菌1h。冷却后，接种厚环乳牛肝菌、点柄乳牛肝菌两种菌种的平板，25±2℃条件下暗培养室培养，4周后备用。

1.2.3 樟子松组培幼苗接种及培养

采用120mm×100mm的育苗杯，首先将灭菌蛭石放在杯底，约20mm深即可，选择生长均匀整齐一致的樟子松组培幼苗，截根(截去主根根尖)，称取生长旺盛的厚环乳牛肝菌、点柄乳牛肝菌固体菌剂30g撒于其上。菌剂必须与苗根接触，以利于菌根的形成。空白对照采用接种30g灭活接种剂，每1个菌种及空白对照均设3次重复，每1个重复接种50株，生长5个月，测定幼苗各项生长指标，包括苗高、地径、总生物量、地上生物量和地下生物量。

1.2.4 菌根形态观察及菌根侵染率的测定

幼苗生长5个月后，每个处理随机抽取10株幼苗。将苗木的根系流水冲洗干净，剪取细根根段，在实体显微镜下观察各处理根系外部特征，判断是否有菌根形成并拍照。采用与Agerer相同的方法，体视显微镜在深色反光纸充当背景条件下，采用白光照射，观察记录菌根的形态，拍照并记录其形态特征。体视显微镜下，取保存于水中的新鲜菌根样品，用镊子和解剖针分层剥下菌套；取1片干净载玻片，在中央滴半滴乳酸，将剥下的菌套碎片，置于玻片乳酸滴上，使有些菌套外层朝上，有些菌套朝下，小心盖上盖玻片，用指甲油封存；显微镜下观察并用电脑照相系统进行拍照并记录特征。取固定于FAA中菌根样品做常规石蜡切片，采用番红固绿双重染色法进行染色，中性树胶封片，干燥后置切片盒保存。制作石蜡切片进行菌根内部形态观察并拍照。

利用网格法[9]统计菌根侵染率，每个处理随机抽取10个营养杯。把营养杯中的幼苗连根拔出，注意不要弄断幼苗的主根和侧根，用蒸馏水冲洗幼苗根系，把附着在根毛上的沙土冲洗干净，用缓冲溶液浸泡幼苗根系5～10min；然后用镊子、剪刀将幼苗根系分成平均长度2cm的小段，放置于画好了1cm×1cm网格的培养皿中，加缓冲溶液并使根段分散的平均分布于网格之内，在高倍数电子显微镜下观察并统计网格中感染的菌根和未被感染的植物根段，计算菌根侵染率。

菌根侵染率=菌根数/总根数×100%,菌根化率=(形成菌根株数/接种株数)×100%。

1.2.5 数据分析

数据处理采用Excel、SPSS18.0 统计分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 接种两种不同的牛肝菌对樟子松组培苗生长的影响

对接种外生菌根真菌5个月的樟子松组培苗进行菌根侵染率及各项生理指标测定得表1。两种外生菌根真菌均与樟子松组培苗形成菌根，菌根化率>95%，菌根侵染率>70%，各项生长指标与CK存在显著性差异，苗高、地径、干重较CK有显著性提高。由此可知，接种外生菌根真菌，可以显著促进宿主植物的生长，尤其是地下生物量的增加。

表1 接种不同菌种的菌根剂对樟子松组培苗生长的影响

注：*表示与CK差异显著(p<0.05)。

2.2 樟子松组培苗形成的菌根形态

对樟子松组培苗形成的菌根进行形态学观察得图1、图2。由图1可知，点柄乳牛肝菌形成菌根的外部形态及解剖结构特征如下：菌根为黄褐色，末端圆钝，明显膨大，多数单轴羽状分支，分支1～2级，紧凑，簇生，呈珊瑚状，少数不分枝；菌根因子长4～10.1mm，直径1～2mm(图1，A)；外层菌套为密丝组织，较薄，透明；菌套内表面与外表面区别不明显(图1，B)；哈蒂氏网深入达到内皮层细胞，由圆形细胞排列于皮层细胞间(图1，C)。

图1 点柄乳牛肝菌与樟子松组培苗形成的菌根外部形态和解剖结构

图2 厚环乳牛肝菌与樟子松组培苗形成的菌根外部形态和解剖结构

由图2可知，厚环乳牛肝菌形成菌根的外部形态及解剖结构特征为，菌根为灰褐色，菌根稍扭曲，末端细尖，不膨大，多级二叉分支，呈珊瑚状；菌根因子长2～6mm，直径1～1.5mm(图2，A，B)，外层菌套为拟薄壁组织(图2，C)，菌丝形成锁状联合(图2，D)，哈蒂氏网深入达到内皮层细胞(图2，E，F)。

3 结论与讨论

接种外生菌根真菌可与樟子松组培苗形成菌根，菌根化率>95%，菌根侵染率>70%，各项生长指标与CK存在显著性差异，说明外生菌根真菌能促进樟子松组培苗的生长，尤其是对地下生物量的影响更为显著。究其原因：首先，菌根形成后，根系的形态结构发生改变，根系的吸收面积扩大，从而促进了宿主植物的生长[11]；其次，菌根真菌在土壤中具有庞大的菌丝网，可降低土壤与植物之间的液流阻力，促进根系对水分的吸收，最大限度地吸收土壤环境中的水分[12]，从而促进组培苗的生长。

点柄乳牛肝菌形成的菌根为黄褐色，末端圆钝明显膨大，多数单轴羽状分支1～2级呈珊瑚状，菌根因子长4～10.1mm，直径1～2mm，菌套内外层区别不明显，哈蒂氏网深入达到内皮层细胞。厚环乳牛肝菌形成的菌根为灰褐色，菌根末端细尖，多级二叉分支呈珊瑚状，菌根因子长2～6mm，直径1～1.5mm，外层菌套为拟薄壁组织，菌丝形成锁状联合，哈蒂氏网深入达到内皮层细胞。

接种外生菌根真菌促进樟子松组培苗的生长是通过分泌植物激素等物质促生长还是改善苗木的根际环境或是直接供给苗木水分、营养物质等而促进苗木生长，有关作用机理还有待于今后进一步更深入地研究。

针叶树种再生植株体系建立最关键的一步即生根，生根率低是针叶树种组培途径的瓶颈所在，严重地制约着针叶树的离体快繁[13～15]。由本试验可知接种外生菌根真菌可显著促进宿主植物地下部分生物量，而如果在组培生根过程中接入菌种，能否促进不定根的生长，有待更进一步的研究。

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Mycorrhizal Technology ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv. with Tissue Culture seedling

ZHANG Wen-quan，LUO Guo-tao,DENG Jie

(Kaili University,Kaili Guizhou 556011，P.R.China)

Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.is one of the main planting tree species in the arid area of northwest China.In order to get a number of plantlets,mycorrhizal synthesis test ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv .with tissue culture seedling were made.An efficiency regeneration system of the plant was established,and inoculateSuillusgrevilleiSing andSuillusgranulatusO.Kurttee,rooting and mycorrhizal research ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.were studied in the experiment.The results showed that multiple growth indices ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.plantlets were improved after inoculatedSuillusgrevilleiSing.The results provided the theoretical basis for the rapid propagation and mycorrhizal technology ofPinussylvestrisvar.mongolicaLitv.

Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.;SuillusgrevilleiSing ;SuillusgranulatusO.Kurttee;tissue culture seedling;mycorrhizal formation

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.027

2015-12-18

凯里学院博士专项课题(凯院合BS201339号)，贵州省科技厅联合基金项目(黔科合LH字[2014]7241号)，贵州省

张文泉(1984-)，男，副教授，主要从事林木生物技术方面的研究。E-mail:zwq840209@yeah.net

S 791.253

A

1672-8246(2016)06-0152-04

教育厅优秀科技创新人才项目(黔教合KY字[2014]251号)。