未治疗HIV感染者NKT样细胞活化、凋亡和增殖的相关研究①

刘婷婷 赵 雪 张子宁 傅雅静 姜拥军

(中国医科大学附属第一医院检验科，卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110000)

·临床免疫学·

未治疗HIV感染者NKT样细胞活化、凋亡和增殖的相关研究①

刘婷婷 赵 雪 张子宁 傅雅静 姜拥军②

(中国医科大学附属第一医院检验科，卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110000)

目的：研究HIV感染后NKT样细胞活化、凋亡和增殖的变化情况。方法：选取47名未治疗的HIV感染者和31名健康对照者，提取外周血细胞，用荧光标记抗体进行染色，利用流式细胞仪检测HIV感染者NKT样细胞HLA-DR、Annexin-V、Ki-67等表面分子的表达。结果：未治疗HIV感染者NKT样细胞百分数为(3.03±1.61)%，正常人NKT样细胞百分数为(8.30±7.42)%，HIV感染者NKT样细胞百分数显著低于健康对照组(P<0.05)；未治疗HIV感染者HLA-DR表达为(5.40±4.10)%，健康对照组HLA-DR表达为(0.89±0.83)%，HIV感染者活化程度明显高于健康对照组(P<0.001)，且活化程度与CD4+T细胞计数呈负相关(r=-0.885 7，P<0.05)；未治疗HIV感染者Annexin-V表达为(30.21±13.15)%，凋亡程度明显高于健康对照组(5.40±8.05)%，(P<0.01)；未治疗HIV感染者Ki-67的表达为(11.15±4.76)%，增殖能力明显低于健康对照组(27.63±18.31)%，(P<0.05)。结论：HIV感染可明显降低NKT样细胞数量及增殖能力，而其活化及凋亡能力增加。

HIV；AIDS；NKT样细胞

自然杀伤样T细胞(Natural killer T like cells,NKT样细胞)是一群同时具有NK细胞和T细胞免疫学特点的天然存在的细胞，可以介导固有免疫和适应性免疫[1,2]。目前国内外对NKT样细胞的认识仍不够全面，根据CD3和CD56的表达情况可将NKT样细胞定义为CD3+和CD56+，既表达TCR又表达NK细胞表面标志物CD56。NKT样细胞在抗肿瘤、抗感染、移植免疫以及自身免疫性疾病中发挥着重要作用[3,4]。艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)， 是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种以CD4+T细胞减少，并伴随反复机会性感染和恶性肿瘤的传染病。目前有研究表明，NKT样细胞在抗病毒感染中也可能发挥着重要作用[5-7]。NKT样细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，分泌大量IFN-γ[8,9]，导致靶细胞死亡。国内外关于NKT样细胞的研究还不是很透彻和全面，尤其是在HIV免疫当中NKT样细胞所发挥的作用及其功能状态。因此，本文主要对HIV感染后NKT样细胞的变化进行研究，并探索其在抗病毒感染中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究选取的未接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者，均来自中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室，经WB(Western blot)试验确认为阳性的HIV/AIDS 患者。其中CD4+T细胞计数范围在31～979 cell/μl，均值为462.5 cell/μl；病毒载量范围在0～2 927 365 copies/ml，均值为132 813.7 copies/ml。正常对照(HIV-negative normal control，NC)，符合以下标准：HIV抗体阴性，血常规及肝肾功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病，未暴露于HIV的正常人。

1.2 主要仪器和试剂 肝素抗凝负压真空采血管、CD3-FITC/CD56-PEcy7/HLA-DR-PerCP/Ki-67-PE、Annexin-V、7AAD等购于BD公司，流式细胞仪为BD公司FACSCalibur。

1.3 流式细胞仪校准 为保证实验准确性,用FACSComp CaliBRITE Beads、TruCOUNT Controls和Multi-Check Control 校准流式细胞仪，合格后再进行标本测定。

1.4 NKT样细胞活化、凋亡、增殖指标检测 200 μl肝素抗凝全血中加入4 ml溶血素，10 min后，离心，洗涤2次后加anti-CD3-FITC、anti-CD56-PEcy7荧光抗体进行NKT样细胞表面染色和HLA-DR-PerCP的活化染色；凋亡指标检测中，NK细胞表面染色20 min，洗涤后进行Annexin-V-PE染色，15 min后加入200 μl凋亡洗液，直接在LSR上检测，该试验需在1 h内完成检测；NK细胞的增殖水平检测是在标记出NK细胞后，破膜20 min，用破膜洗液洗涤2次后进行胞内Ki-67-PE染色。见图1。

1.5 统计学分析 用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析，两组间实验指标的比较采用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV感染后NKT样细胞百分数变化情况 对16例HIV感染者和11例健康对照者进行CD3/CD56表面染色，检测NKT样细胞百分数。结果显示：未治疗HIV感染组NKT样细胞百分数为(3.03±1.61)%，健康对照组NKT样细胞百分数为(8.30±7.42)%，HIV组明显低于NC组(P<0.05)，见表1、图2，差异具有统计学意义。

2.2 HIV感染后NKT样细胞活化情况 将14例HIV感染者和9例健康对照者的新鲜全血进行NKT样细胞表面染色(CD3/CD56)及活化标志(HLA-DR)染色。结果显示：未治疗HIV感染组NKT样细胞HLA-DR表达的百分数为(5.40±4.10)%，健康对照组HLA-DR表达的百分数为(0.89±0.83)%，因此NKT样细胞在HIV感染者中，HLA-DR表达量明显高于NC组(P<0.001)，见图3、表2。NKT样细胞活化程度与CD4+T细胞计数有负相关趋势(P<0.05，r=-0.885 7)，见图4。

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup16303±161<005Normalcontrolgroup11830±742

图1 画门策略及代表流式图Fig.1 Gate strategy and representative flow chart

2.3 HIV感染后NKT样细胞凋亡情况 将16例HIV感染者和11例健康对照者的新鲜抗凝全血进行NKT样表面染色(CD3/CD56)及凋亡标志(Annexin-V)染色。结果显示：未治疗HIV感染者

图2 HIV感染及健康对照者NKT样细胞百分数Fig.2 Percentage of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

图3 HIV感染及健康对照者NKT样细胞HLA-DR表达Fig.3 HLA-DR expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup14540±410<005Normalcontrolgroup9089±083

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup16540±805<005Normalcontrolgroup113021±1315

Annexin-V表达的百分数为(5.40±8.05)%，凋亡程度明显高于健康对照组(30.21±13.15)%(P<0.01)，见图5、表3。

2.4 HIV感染后NKT样细胞增殖情况 将17例HIV感染者和11例健康对照者新鲜抗凝全血破膜后，进行细胞核活跃指标(Ki-67)染色。结果显示：未治疗HIV感染者Ki-67表达的百分数为(11.15±4.76)%，健康对照组Ki-67表达的百分数为(27.63±18.31)%，因此NKT样细胞在HIV组中细胞核活跃程度Ki-67明显低于NC组(P<0.05)，见图6、表4。

图4 HIV感染NKT样细胞活化程度与CD4+T细胞计数的相关性Fig.4 Correlation between HLA-DR of NKT like cell and CD4+T cell count

图5 HIV感染及健康对照者NKT样细胞Annexin-V表达情况Fig.5 Annexin-V expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

图6 HIV感染及健康对照者NKT样细胞Ki-67表达情况Fig.6 Ki-67 expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup171115±476<005Normalcontrolgroup112763±1831

3 讨论

NKT样细胞是具有T细胞与NK细胞两方面性质的一类特殊的淋巴细胞，其表面可以同时表达T 细胞受体(T-cell antigen receptors，TCR)和NK细胞受体(NK associated receptors，NKR)[10,11]。NKT样淋巴细胞是天然免疫和固有免疫之间的桥梁，在抗感染免疫应答、抗肿瘤免疫监视和自身免疫性疾病中均起到重要的作用。

我们以中国HIV感染者为研究对象，通过检测HIV感染后NKT样细胞的数量变化，以及活化、凋亡和增殖状态的改变，来进一步分析HIV 感染后NKT样细胞的功能状况及其抗病毒作用。我们的结果显示:HIV感染者NKT样细胞百分数低于正常对照组(P<0.05)。表明HIV 感染后NKT样细胞数量减少[12,13]，提示NKT样细胞在HIV疾病进展过程中发挥的抑制HIV病毒复制和杀伤病毒感染细胞的作用减弱。我们发现HIV感染后，NKT样细胞增殖能力降低(P<0.05)，表明HIV感染者的NKT样细胞功能受到了损害[14]，而其增殖能力的降低也可能是其感染HIV后数量减少的原因之一。HIV感染后NKT样细胞活化程度显著增加(P<0.001)，提示尽管HIV感染后NKT样细胞数量减少了，但其仍能够发挥部分抗HIV感染作用，活化后分泌IFN-γ对抗病毒感染，且NKT样细胞活化程度与CD4+T 细胞数量成反比(P<0.05，r=-0.885 7)(图3)。

我们的研究还发现在HIV感染后NKT样细胞凋亡增加，什么原因导致其凋亡增加目前仍不清楚，可能是由于HIV感染后NKT样细胞的凋亡易感性增加了。但NKT样细胞在HIV感染后凋亡的增加也可能是其数量减少的原因之一。由此看来,HIV感染无论是对NKT样细胞数量还是对活化程度、增殖以及凋亡都有一定的影响，对HIV感染后NKT样细胞的变化进行不断深入的研究，利用NKT样细胞的独特性为HIV感染后的免疫重建及抗HIV治疗提供相应的科学依据及理论基础。

[1] Vasan S,Tsuji M.A double-edged sword:the role of NKT cells in malaria and HIV infection and immunity[J].Semin Immunol,2010,22(2):87-96.

[2] Carvalho KI,Bruno FR,Snyder-Cappione JE,etal.Lower numbers of natural killer T cells in HIV-1 and Mycobacterium leprae co-infected patients[J].Immunology,2012,136(1):96-102.

[3] Taniguchi M,Harada M,Dashtsoodol N,etal.Discovery of NKT cells and development of NKT cell-targeted anti-tumor immunotherapy[J].Proc Jpn Acad Ser B Physi Biol Sci,2015,91(7):292-304.

[4] 李子涛，杨滨燕,吴长有.人外周血NKT细胞亚群表型及生物学特征[J].中国免疫学杂志,2011,27(2):110-114.

[5] Flach B,Naluyima P,Blom K,etal.Differential loss of invariant natural killer T cells and FoxP3(+) regulatory T cells in HIV-1 subtype A and subtype D infections[J].J Acquir Immune Defic Syndr,2013,63(3):289-293.

[6] Vasan S,Poles MA,Horowitz A,etal.Function of NKT cells,potential anti-HIV effector cells,are improved by beginning HAART during acute HIV-1 infection[J].Int Immunol,2007,19(8):943-951.

[7] Kuylenstierna C,Snyder-Cappione JE,Loo CP,etal.NK cells and CD1d-restricted NKT cells respond in different ways with divergent kinetics to IL-2 treatment in primary HIV-1 infection[J].Scand J Immunol,2011,73(2):141-146.

[8] Jiang Y,Cui X,Cui C,etal.The function of CD3+CD56+NKT-like cells in HIV-infected individuals[J].Biomed Res Int,2014,2014:863625.

[9] Rout N,Greene J,Yue S,etal.Loss of effector and anti-inflammatory natural killer T lymphocyte function in pathogenic simian immunodeficiency virus infection[J].PLoS Pathogens,2012，8(9):e1002928.

[10] Padte NN,Li X,Tsuji M,etal.Clinical development of a novel CD1d-binding NKT cell ligand as a vaccine adjuvant[J].Clin Immunol,2011,140(2):142-151.

[11] 樊 昕.NKT细胞与HIV-1相关性的研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(Suppl):142-151.

[12] Parasa VR,Selvaraj A,Sikhamani R,etal.Interleukins 15 and 12 in combination expand the selective loss of natural killer T cells in HIV infection in vitro[J].Clin Exp Med,2015,15(2):205-213.

[13] Fernandez CS,Kelleher AD,Finlayson R,etal.NKT cell depletion in humans during early HIV infection[J].Immunol Cell Biol,2014,92(7):578-590.

[14] Moll M,Kuylenstierna C,Gonzalez VD,etal.Severe functional impairment and elevated PD-1 expression in CD1d-restricted NKT cells retained during chronic HIV-1 infection[J].Eur J Immunol,2009,39(3):902-911.

[收稿2016-04-05 修回2016-04-27]

(编辑 倪 鹏)

Studies on activation,apoptosis and proliferation of NKT like cells in untreated HIV infected patients

LIU Ting-Ting，ZHAO Xue，ZHANG Zi-Ning，FU Ya-Jing，JIANG Yong-Jun.

Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital,China Medical University，Key Laboratory of AIDS Immunology of Ministry of Health,Shenyang 110000,China

Objective:To study the changes of the NKT like cells after HIV infected.Methods: We collected peripheral blood from 47 untreated HIV infected individuals and 31 healthy controls,and analyzed the expression of Annexin-V,Ki-67,HLA-DR and other surface molecules in NKT like cells by flow cytometry.Results: The NKT like cell percentage of untreated HIV infected group was (3.03±1.61)%,the NKT like cell percentage of normal control group was (8.30±7.42)%,the percentage of NKT like cells in HIV infected individuals was significantly lower than the healthy controls (P<0.05)；the NKT like cell HLA-DR expression of untreated HIV infected group and normal control group were (5.40±4.10)% and (0.89±0.83)%,the NKT like cell Annexin-V expression of untreated HIV infected group and normal control group were (30.21±13.15)% and (5.40±8.05)% ,and the activation and apoptosis of NKT like cells was significantly higher after HIV infection compared with health individuals (P<0.001，P<0.01)，the degree of activation was negatively correlated with CD4 count (r=-0.885 7，P<0.05)；and the NKT like cell Ki-67 expression of untreated HIV infected group and normal control group were (11.15±4.76)% and (27.63±18.31)%，the proliferation ability was significantly lower after HIV infection compared with healthy controls(P<0.05).Conclusion: HIV infection can significantly reduce the number of NKT like cells and its ability to proliferate,and increase its ability to activation and apoptosis.

Human immunodeficiency virus；Acquired immune deficiency syndrome;NKT like cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.016

①本文为国家科技重大专项课题资助项目(2014ZX1000100 2001004)和基础临床紧密结合平台项目(医大发字[2013]5号)。

刘婷婷(1990年-)，女，硕士，初级检验技师，主要从事艾滋病相关方面的研究。

R512.91

A

1000-484X(2016)12-1797-04

②通讯作者，E-mail：jiangjun55555@163.com。