氧化苦参碱联合5-FU对人胃癌SGC-7901细胞生长的协同抑制作用及其机制研究

刘 阳 刘 念 刘 文

(江汉大学附属医院普外科，武汉430015)

氧化苦参碱联合5-FU对人胃癌SGC-7901细胞生长的协同抑制作用及其机制研究

刘 阳 刘 念 刘 文

(江汉大学附属医院普外科，武汉430015)

目的：氧化苦参碱联合5-FU对人胃癌SGC-7901细胞生长的协同抑制作用及相关机制研究。方法：通过不同浓度的氧化苦参碱单独及联合应用5-FU作用于SGC-7901细胞24、48、72 h，采用MTT法检测细胞活力，HOECHST染色法检测细胞凋亡，免疫细胞法检测胃癌 SGC-7901细胞内血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达，以逆转录聚合酶链式反应RT-PCR法观察SGC-7901细胞VEGF mRNA的转录情况。结果：与空白组比，氧化苦参碱中剂量、高剂量组及其联合5-FU组均能显著抑制人胃癌SGC-7901细胞生长，并诱导其凋亡(P<0.01)；与单独使用5-FU组相比，联合用药组细胞增殖抑制率和凋亡率均显著增高(P<0.05)；氧化苦参碱及联合5-FU组中人胃癌SGC-7901细胞的VEGF mRNA转录及其蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论：氧化苦参碱对5-FU的胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制和诱导凋亡具有协同作用；促进氧化苦参碱对VEGF的基因和蛋白表达抑制作用可能是其机制之一。

氧化苦参碱；5-氟尿嘧啶；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡；血管内皮生长因子

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率也逐渐增加，严重威胁着人们的健康，目前对其治疗方式有：手术、化疗、放疗或多种方法综合治疗，晚期胃癌患者较为常见，而鉴于其起病隐匿、无明显症状等发病特点，其治疗多以化疗为主。在临床上对胃癌化疗的首选药为5-氟尿嘧啶(5-FU)[1，2]，是抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡抗肿瘤药的重要机制之一。在大部分抗肿瘤药物中，中药因其高效低毒的特性，逐渐得到人们的重视，尤其是对抗肿瘤中药中有效成分的研究。苦参作为传统中药，在临床上广泛应用，具有抗病毒、抗过敏、平喘等功效。其主要有效成分氧化苦参碱已成为肝炎的临床治疗药物，其不良反应小，且有升高白细胞和提升免疫力的功效，而对机体正常细胞影响较小。研究表明氧化苦参碱对肿瘤细胞具有一定的杀伤和抑制其侵袭的作用[3-5]，在临床上正得到较为广泛应用。目前中药及其中药成分联合运用治疗胃癌有一定报道，如冯玉光等[6]人研究发现丹参酮ⅡA可显著增强5-FU对SGC7901细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，该效应可能与其抑制突变型p53蛋白的表达有关。而虽对氧化苦参碱治疗胃癌有一定报道，但对氧化苦参碱联合5-FU的抗肿瘤作用却未见相关报道，本文研究研究了不同浓度氧化苦参碱单用和联合5-FU作用胃癌细胞，以观察二者是否具有协同作用。同时研究表明血管生成促进因子主要包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，其中VEGF是主要的促血管生成因子，在胃癌的侵袭和转移中起重要作用；中药可通过对VEGF的表达及活性的调控影响肿瘤的血管生成，进而抑制肿瘤的生长和转移[7-11]，因此本研究检测氧化苦参碱单用和联合5-FU对VEGF基因和蛋白表达的影响，以研究其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 小牛血清(杭州四季青)；氧化苦参碱(中国药品生物制品检定所的标准品)；氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司)；HOECHST32258 荧光染色试剂盒(美国Sigma 公司)；兔抗人VEGF多克隆抗体、SP-9000免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉公司)；RNA提取试剂TRIZOL和2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化公司)。

1.1.2 细胞培养 将SGC7901 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液中，在5%CO2、37℃的培养箱中进行传代培养。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定细胞增殖抑制率 以3×107L-1的密度将处于对数生长期的细胞接种于96孔的培养板中，每空200 μl。当细胞贴壁后，加入氧化苦参碱(终浓度为0、1、2、4 mg/L)及氧化苦参碱(终浓度为0、1、2、4 mg/L)联合5-FU(终浓度10.0 mg/L)，每组设5个复孔。分别连续培养24、48和72 h后，每空加20 μl的MTT溶液(50 mg/L)，继续培养4 h，吸尽上清液，每孔加150 μl的二甲基亚砜，震荡5 min，用酶标仪在570 nm下，检测其OD值。细胞生长抑制率(%)= (对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值×100%。

1.2.2 HOECHST染色法检测细胞凋亡率 将SGC7901细胞制成细胞悬液(2×108L-1)，加入带有盖玻片的24孔板内，每孔加0.5 ml。当细胞贴壁后，加入氧化苦参碱(终浓度为0、1、2、4 mg/L)及氧化苦参碱(终浓度为0、1、2、4 mg/L)联合5-FU(终浓度10.0 mg/L)，每组设5个复孔。分别连续培养24、48和72 h后，取出各组细胞爬片，用甲醇/冰醋酸固定液固定，5 min后，加入HOECHST33258荧光染液，避光1 h后，再用PBS冲洗后用抗荧光液对其进行封片。判断其存活或凋亡标准：蓝色为存活，白色为凋亡。凋亡率(%)= 凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3 免疫细胞化学法观察胃癌细胞VEGF蛋白表达 以1×105L-1的密度将处于对数生长期的细胞接种于24孔的培养板中，每空200 μl。当细胞贴壁后，加入氧化苦参碱(终浓度为0、4 mg/L)及氧化苦参碱(终浓度为4 mg/L)联合5-FU(终浓度10.0 mg/L)。连续培养48 h后，PBS洗涤3次，干燥后，加入0.3%H2O2，孵育15 min，PBS洗涤，加山羊血清，孵育15 min，照试剂盒操作步骤说明滴加一抗、二抗，结果用Image Pro Plus软件进行分析。

1.2.4 RT-PCR法检测氧化苦参碱单用及联合5-FU对细胞VEGF mRNA表达的影响 ①总RNA的提取及逆转录：将药物作用48 h后的细胞按Trizol试剂盒(TIANGEN)说明书提取总RNA，按照逆转录试验盒(TIANGEN)说明逆转录成cDNA。②基因扩增：取得的cDNA行25 ml PCR反应。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，其基因扩增物为252 bp；VEGF 产物为417 bp。③扩增产物应用凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，并对条带进行光密度扫描分析。各组mRNA的相对表达量等于其目的基因VEGF条带积分光密度值与其内参照β-actin的条带积分光密度值的比值。

2 结果

2.1 不同浓度氧化苦参碱单独及联合应用5-FU对SGC7901细胞增殖的抑制作用 由表1可知，中剂量和高剂量氧化苦参碱组对SGC7901细胞增殖的具有显著的抑制作用(P<0.01)，且随浓度和时间的增加抑制作用增强；与单独氧化苦参碱用组相比，对应的联合用药组对SGC7901细胞增殖的抑制作用显著增高(P<0.05)。

2.2 不同浓度氧化苦参碱单独及联合5-FU对SGC7901细胞凋亡的影响 由表2知，中剂量和高剂量的氧化苦参碱对SGC7901细胞凋亡具有显著促进作用(P<0.01)，而低剂量作用不显著(P>0.05)；且随浓度和时间的增加促进作用增强，高剂量组细胞72 h凋亡率高达46.89%；与单独氧化苦参碱组相比，对应的联合用药组促进凋亡作用显著增高(P<0.05)，4 mg/L氧化苦参碱+5-FU组高达50.89%。

2.3 氧化苦参碱单独及联合应用5-FU对SGC7901细胞VEGF蛋白表达影响 由图1及表3知，与对照组相比，4 mg/L氧化苦参碱组和4 mg/L氧化苦参碱+10 mg/L的5-FU组SGC7901细胞VEGF蛋白表达显著下降(P<0.01)，而5-FU组下降不明显(P>0.05)。

表1 不同浓度氧化苦参碱单独及联合应用5-FU对SGC7901细胞增殖的抑制作用

Tab.1 Inhibition effects of different concentrations Oxym-atrine and it combined with 5-FU proliferation of SGC7901 human gastric cancer cells

Group24h(%)48h(%)72h(%)K000A1644±2442435±3352659±359B3238±3381)3833±4331)4389±3891)C4989±2891)5613±1131)6034±4341)5⁃FU1934±2342435±2352659±459A+5⁃FU2055±1551)2)2831±3311)2)3022±2221)2)B+5FU3718±2181)2)4073±3731)2)4829±4291)2)C+5FU5639±1391)2)3)6416±2161)2)3)6988±3881)2)3)

Note：K.Control group;A.1 mg/L Oxymatrine group;B.2 mg/L Oxymatrine group;C.4 mg/L Oxymatrine group;5-FU.10 mg/L Oxymatrine group;A+5-FU.1 mg/L Oxymatrine +10 mg/L;5-FU group;B+5FU.2 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;C+5FU.4 mg/L Oxymatrine+10 mg/L 5-FU group.1)P<0.05,compared to controls;2)P<0.05.compared to single drug (Oxymatrine) group;3)P<0.05.compared to single drug (5-FU) group.

表2 不同浓度氧化苦参碱单独及联合5-FU对SGC7901细胞凋亡的影响结果

Tab.2 Inhibition effects of different concentrations Oxym-atrine and it combined with 5-FU apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells

Group24h(%)48h(%)72h(%)K471±144511±135642±159A624±244822±335922±359B2022±3381)2411±4331)2712±3891)C4022±2891)4422±1134689±4341)5⁃FU1523±2341)1722±2351)2022±4591)A+5⁃FU1625±1551)2)1822±3311)2)2422±2221)2)B+5FU2522±2181)2)2611±3731)2912±4291)C+5FU4322±1391)2)3)4622±2161)2)3)5089±3881)2)3)

Note：K.Control group;A.1 mg/L Oxymatrine group;B.2 mg/L Oxymatrine group;C.4 mg/L Oxymatrine group;5-FU.10 mg/L Oxymatrine group;A+5-FU.1 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;B+5FU.2 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;C+5FU.4 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group.1)P<0.05,compared to controls;2)P<0.05.compared to single drug (Oxymatrine) group；3)P<0.05 compared to single drug (5-FU) group.

2.4 RT-PCR检测细胞内VEGF mRNA的表达结果 由图2和表4可知，与对照组相比，4 mg/L氧化苦参碱组和4 mg/L氧化苦参碱+10 mg/L的5-FU组SGC7901细胞VEGF基因表达显著下降(P<0.01)，而5-FU组下降不明显(P>0.05)。

图1 免疫组化法检测氧化苦参碱单独及联合应用5-FU处理组细胞内VEGF蛋白表达(DAB×400)Fig.1 Immunohistochemical staining for VEGF in Oxy-matrine and it combine with 5-FU (DAB×400)

表3 氧化苦参碱单独及联合应用5-FU对VEGF蛋白表达影响

Tab.3 Immunohistochemical staining for VEGF in Oxy-matrine and it combine with 5-FU

Note：1)P<0.05，compared to controls；2)P<0.05，compared to 10 mg/L 5-FU group；3)P<0.05，compared to 4 mg/L Oxymatrine group.

表4 氧化苦参碱单独及联合应用5-FU对SGC-7901细胞VEGF mRNA转录的影响

Tab.4 Impacts of Oxymatrine and it combine with 5-FU to transcription of VEGF mRNA in SGC-7901 cells

GroupsVEGFControlgroup0812±002610mg/L5⁃FUgroup0752±00874mg/LOxymatrinegroup0522±00391)4mg/LOxymatrine+10mg/L5⁃FUgroup0459±00681)2)3)

Note：1)P<0.05，compared to controls；2)P<0.05，compared to 10 mg/L 5-FU group；3)P<0.05，compared to 4 mg/L Oxymatrine group.

图2 半定量RT-PCR检测细胞内VEGF mRNA的表达Fig.2 Expression of VEGF mRNA was detected by semi-quantitative RT-PCRNote:M.Marker PRI 2000;A.10 mg/L 5-FU;B.4 mg/L Oxymatrine;C.4 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU ;D.Control.

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率也逐渐增加，严重威胁着人们的健康，目前其治疗方式有：手术、化疗、放疗或多种方法综合治疗，而鉴于其起病隐匿、无明显症状等发病特点，其治疗多以化疗为主。目前多研究胃癌的转移机制，以探索治疗的新靶点[12-14]。苦参为豆科槐属植物，主要分布于河北北部、河南西部及山东等地[15]，主要成分以生物碱类为代表如苦参碱、氧化苦参碱、怀果碱等等。苦参具有清热解毒、燥湿利尿、祛风杀虫等作用，现对苦参及其生物碱的抗肿瘤作用有较多报道[3-5]。虽对氧化苦参碱治疗胃癌有一定报道，但对氧化苦参碱联合5-FU的抗肿瘤作用却未见相关报道，本文研究研究了不同浓度氧化苦参碱单用和联合5-FU作用胃癌细胞，以观察二者是否具有协同作用，同时检测VEGF基因和蛋白表达，研究其相关机制。本文研究结果表明中剂量和高剂量的氧化苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有显著抑制作用和诱导其凋亡作用，且在剂量上，高剂量作用大于中剂量；在时间上，72 h作用大于48 h，48 h大于24 h，而低剂量氧化苦参碱的抑制作用不明显，该结果提示氧化苦参碱对胃癌细胞增殖具有显著抑制作用，该作用呈剂量和时间依赖性。同时，研究了氧化苦参碱与5-FU联合用药对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有显著抑制作用和诱导其凋亡作用，结果表明，联合用作用显著强于单独用药，提示氧化苦参碱与5-FU在抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导其凋亡上具有一定的协同作用。

通过抑制血管生成治疗肿瘤早有研究报道，且具有较多优点如广谱性、不易产生耐药性等等[7,16-18]。同时研究表明血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的主要促进因子，其在胃癌的侵袭和转移中具有重要作用[15]。因此，进一步检测了氧化苦参碱及其联合5-FU用药对SGC-7901细胞VEGF基因和蛋白表达的影响，以对相关机制进行研究，结果发现氧化苦参碱和氧化苦参碱联合5-FU用药组能显著抑制SGC-7901细胞VEGF基因和蛋白表达，而单独用5-FU组作用不显著，提示抑制SGC-7901细胞VEGF基因和蛋白表达可能是氧化苦参碱联合5-Fu对人胃癌SGC-7901细胞生长的协同抑制作用机制之一。

综上，氧化苦参碱对胃癌细胞增殖具有显著抑制作用，该作用呈剂量和时间依赖性；氧化苦参碱与5-FU在抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导其凋亡上具有一定的协同作用，其协同作用的相关机制可能是5-FU促进、增加了氧化苦参碱的抑制SGC-7901细胞VEGF基因和蛋白表达作用，从而抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡。本研究为以后采用单独用药及联合用药治疗胃癌提供了理论依据，具有一定的参考价值。

[1] Yoshida K,Yamaguchi K,Osada S,etal.Challenge for a better combination with basic evidence [J].Int J Clin Oncol,2008,13(3):212-219.

[2] 李卫泊,宋伟庆,张玉印,等.5-氟尿嘧啶术前化疗对胃癌细胞凋亡和增殖的影响[J] .中华肿瘤防治杂志,2006,13(14):1077-1079.

[3] Liu J，Manheimer E，Tsutani K,etal.Medicinal herbs for hepatitis C virus infection:a Cochrane hepatobiliary systematic review of randomized trials [J].Am J Gastroenterol,2003,98(3):538-544.

[4] 夏宝妹,周怀君,胡娅莉,等.氧化苦参碱对子宫内膜癌细胞中血管内皮生长因子表达的抑制作用及其机制[J].中华妇产科杂志,2009,44(5):388-390.

[5] 李 敏,钱晓萍,刘宝瑞.奥沙利铂联合复方苦参注射液抗血管生成作用的实验研究[J].中国癌症杂志,2008,18(3):167-171.

[6] 冯玉光，刑国辉，宗绪山，等.丹参酮ⅡA联合5-FU对人胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡与突变型p53蛋白表达的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2010，17(11)：831-834.

[7] Ding S,Lin S,Dong X,etal.Potential prognostic value of circulating levels of vascular endothelial growth factor-A in patients with gastric cancer [J].In Vivo,2005,19(4):793-795.

[8] 闵存云,刘和强,李庆明.健脾导滞中药对胃癌细胞VEGF及其受体表达的作用[J].中华实用中西医杂志,2005,18(9):1351-1353.

[9] 徐 莉,丁志山,魏颖慧,等.参麦注射液对胃癌中bFGF、PCNA基因表达的影响[J].中成药,2006,28(4):530-532.

[10] 曹文涛,廖爱军,曾 斌,等.藜芦醇对胃癌SGC-7901细胞VEGF表达的影响[J].现代生物医学进展,2006,6(10):52-54.

[11] 王国平,尹成进,欧阳曙明,等.雷公藤内酯醇对人胃癌细胞SGC 7901增殖及表达血管内皮生长因子的影响[J].实用医学杂志,2008,24(1):17-19.

[12] Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,etal.Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors[J].FASEB J,1999,13(1):9-22.

[13] Ferrara N,Gerber HP,Le Couter J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med,2003,9(6):669-676.

[14] Hotz HG,Hines OJ,Masood R,etal.VEGF antisanse therapy inhibits tumor growth and improves survival in experimental pancreatic cancer[J].Surgery,2005,137(2):192-199.

[15] 付起凤，曹 琦，吕邵娃，等.正交法优化苦参中苦参生物碱的超声提取工艺[J].中医药信息，2015，32(1)：11-13.

[16] Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? [J].Nat Cancer Inst，1990,82(1):4-6.

[17] Grothey A,Ellis LM.Targeting angiogenesis driven by gascular endothelial growth factors using antibody-based therapies [J].Cancer J,2008,14(3):170-177.

[18] Ferrara N.VEGF as a therapeutic target in cancer [J].Oncology,2005,69(suppl3):11-16.

[收稿2016-03-25 修回2016-05-05]

(编辑 许四平)

Effect of combination Oxymatrine with 5-FU inhibited proliferation in SGC-7901 human gastric cancer cells and its mechanism

LIU Yang,LIU Nian,LIU Wen.

General Surgery,Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430015，China

Objective:To study the synergy inhibition effects of Oxymatrine combine with 5-FU on proliferation and apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells and its mechanism.Methods:SGC7901 cells were treated by different concentrations of Oxymatrine with or without 10.0 mg/L 5-FU for 24,48 and 72 h.The cells proliferative vitality was detected by MTT assay,and the apoptosis of SGC7901 cells was detected by HOECHST stain.Immunohistochemistry was applied to examine the protein expression of VEGF.The transcriptions of VEGF mRNA were distinguished by RT-PCR technique.Results:Compared with control group,middle dose and high dose concentration of Oxymatrine groups,and groups of its combined with 5-FU can inhibit the proliferation and induced the apoptosis of SGC7901 cancer cells.Compared with 5-FU group,the inhibition rate and apoptosis rate were significantly increased in groups of Oxymatrine combined with 5-FU.The mRNA and protein expression of VEGF were significantly decreased in groups of Oxymatrine and it combined with 5-FU.Conclusion:Synergy inhibition effects of Oxymatrine combine with 5-FU on proliferation and apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells were found,which may be related to strengthen the effects of Oxymatrine of inhibiting angiogenesis relate with down-regulating the expression of VEGF.

Oxymatrine;5-FU;Gastric cancer;Proliferation;Apoptosis;VEGF

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.012

刘 阳(1978年-)，男，硕士，主治医师，主要从事胃肠道肿瘤方面的研究，E-mail：liuyang887811@163.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1781-05