TLR3-TBK1-IRF-3信号通路在EV71手足口病脑损伤中的机制研究

温正旺 陈洁 金龙腾 陈益平 蔡晓红 李昌崇

·临床研究·

TLR3-TBK1-IRF-3信号通路在EV71手足口病脑损伤中的机制研究

温正旺 陈洁 金龙腾 陈益平 蔡晓红 李昌崇

目的探索干扰素TLR3-TBK1-IRF-3信号通路在EV71手足口病脑炎中枢神经系统损伤中的作用机制。方法选取2014年1月至2015年1月手足口病患儿144例（观察组）及健康体检儿童36例（对照组），通过脑脊液检查及临床诊断，分成5组，正常儿童体检组、普通手足口病儿童2d组（A组）、普通手足口病儿童5d组（B组）、手足口病脑炎2d组（C组）、手足口病脑炎5d组（D组），每组各36名儿童，用ELISA方法检测患儿血液中TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白及干扰素的表达水平。结果观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组和C组差异无统计学意义，B组明显高于D组（P＜0.01），A组与B组、D组与C组差异无统计学意义；观察组TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF及蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组和C组比较差异无统计学意义，B组明显高于D组（P＜0.01），B组高于A组（P＜0.01）、D组与C组比较差异无统计学意义。结论手足口病脑炎患儿干扰素及TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白的表达水平较正常儿童明显升高，但比普通手足口病患儿较低，提示TLR3-TBK1-IRF-3信号通路对手足口病脑炎具有一定的诊断意义。

EV71 手足口病 脑炎 干扰素

手足口病是一种较为严重的传染性疾病，主要好发于学龄前儿童，严重者可并发手足口病脑炎，这类患者中，绝大多数由EV71病毒感染引起。EV71如何导致手足口病脑炎的分子机制仍研究甚少，目前研究发现干扰素可以影响EV71手足口病脑炎的进展及预后，干扰素在体内主要包括产生和应答机制，本课题将干扰素的产生机制作为一个切入点，从分子生物学机制上研究干扰素的产生信号通路对EV71手足口病脑炎的影响，为手足口病脑炎的及时诊疗及研究提供一个新的靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2014年1月至2015年6月本院手足口病患儿144例为观察组，男72例，女72例；年龄6个月～3岁。均经脑脊液、粪便EV71抗原检查及临床表现确诊，排除合并其它疾病。依据病情及时间分成4组，手足口病患儿2d组（A组）、5d组（B组）；手足口病脑炎患儿2d组（C组）、5d组（D组），每组各36例。另选择同期健康体检儿童36例为对照组，男18例，女18例，年龄6月～3岁。各组一般资料比较差异无统计学意义。本课题中手足口病脑炎患儿经过积极治疗后，病情基本稳定，住院后治愈出院，未出现转为危重型的病例。

1.2 方法 采用Elisa法检测各组中TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF及干扰素的蛋白表达（试剂盒由博士得公司提供），在每日清晨抽取各组的外周静脉血1.5 ml，共5组，加入 24孔培养板中，每孔加入40μl 血，第1 孔加入生理盐水作为基础对照，第2、3、4、5、6 孔作阳性对照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔者分别用生理盐水稀释成 50g/ml，加入总量均为200μl，加入抗原后轻微摇动20s，37℃水浴中孵育时长16～20h，抽取血浆上清液适量，于-20℃冰箱冷冻备用，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。干扰素的释放水平检测严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS 12.0统计软件。各组正态计量资料数据以（x±s）表示，用one-way ANOVA方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane's T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组和C组比较差异无统计学意义，B组明显高于D组（P＜0.01），B组高于A组（P＜0.01）、D组与C组比较差异无统计学意义。观察组TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），A组和C组比较差异无统计学意义，B组明显高于D组（P＜0.01），B组高于A组（P＜0.01）、D组与C组比较差异无统计学意义。见表1。

表1 各组蛋白的表达水平比较（μg/mL）

3 讨论

手足口病多发生于＜3岁儿童，在患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，预后差异性很大，个别重症患儿病情发展快，导致死亡［1］。目前仍缺乏有效治疗药物，主要对症治疗。手足口病脑炎多是由肠道病毒感染引起，据流行病学调查，EV71、CA16、CVA4、CVA5、CVA9、CVA10、CVB1、CVB3和CVB5等9种病毒可引起手足口病［2］，其中EV71病毒是导致手足口病最常见的一种病毒，绝大多数的手足口病脑炎多由EV71病毒感染引起，2012年上海进行一次手足口病高危因素的筛查中，EV71病毒感染更易诱发手足口病乃至手足口病脑炎［3］，目前对EV71病毒的检测及EV71病毒感染的治疗存在滞后性及缺乏针对性。有研究提示用EV71病毒感染小鼠的神经细胞可以导致神经细胞的损伤，这些研究提示EV71攻击性较强，在新生小鼠体内如何导致神经系统的损伤，其病理生理机制尚未明确，本文将干扰素的产生机制作为研究EV71手足口病脑炎的研究靶点。

干扰素作为一类高活性多功能的糖蛋白，能诱导细胞对病毒感染产生抗性，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品［4］。其可以分为I 型干扰素、II型干扰素和III 型干扰素三大类。IFN-Ⅰ中α、β和IFN-II具有较强的抗病毒、抗肿瘤活性并且在病毒感染引起的免疫应答中起重要的调节作用，长期作为有效的抗病毒与抗肿瘤药物应用于临床，对其抗病毒、抗肿瘤机制的研究，一直是病毒学研究的热点。Lu等［5］研究认为，在EV71感染后，TYK2的表达受到抑制，EV71感染可以通过抑制干扰素信号通路上相关因子的表达，从而对机体产生严重的损伤作用。

在临床中对EV71感染的手足口病脑炎患儿使用干扰素制剂可以有效起到控制症状及减少住院时间的作用，如重组人干扰素等。在探讨 EV71感染手足口病重症患儿的免疫状态时，通过ELISA方法检测血清中干扰素的含量，发现相较于对照组，重症组及普通组均有升高，但普通组升高更为明显，各组之间的比较差异均有统计学意义，这与本资料结果一致，提示重症感染在一定程度上抑制了干扰素的表达［6］。

干扰素存在应答及产生信号通路，主要通过它的产生信号通路发挥作用。在干扰素产生信号通路的上游，存在一种TLR3 受体，其是toll 样受体中的一员，是病毒dsRNA识别受体，由于dsRNA是病毒复制过程中普遍存在的产物，因此 TLR3在宿主抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用［7］。当病毒侵袭机体时，TLR3会出现明显升高。在小鼠的单纯疱疹病毒脑炎模型中，发现TLR3活化诱导的TNF-α过度表达，血脑屏障通透性增加，病毒直接进入脑部，对神经系统造成严重损伤［8］。TLR3是干扰素产生信号通路上的一个重要应激因子，多数病毒感染都涉及到TLR3的表达，其中包括EV71病毒，它在多种细胞中广泛表达［9］；尤其在神经突触细胞中表达最为丰富，主要功能是识别病毒感染并诱导干扰素的产生，作为干扰素产生信号通路的上游因子，TLR3可以影响下游信号因子的表达。

TLR3可以通过两种途径来产生干扰素，介导病毒感染对机体的影响。一种与NEMO基因相关，涉及到DsDNA，它是一种病原相关性受体模型，可以被TLR3识别，激活特定的转化因子，从而诱导抗病毒基因的激活，被称为基因途径。另一种途径是通过介导TRIF，TRIF最初被认为是一种传导来源于活化TLR3信号的蛋白，新近的研究肯定了这一作用，TRIF与TLR3均有一个共同的TIR（翻译起始区），二者通过这个区域进行信号传递，有研究提示敲除TRIF的TIR可以抑制TLR-3介导的信号传递［10］。TRIF蛋白缺乏或者缺失的小鼠在LPS作用下呈现出炎症细胞因子生成障碍。另外有研究提示TBK1（NF-kB活化分子结合激酶-1）可以作为IRF-3的激酶，不仅与IRF-3、而且与TRIF连接，SAto等也发现TBK-1与TRIF-N端连接作用于IRF-3，其中IRF-3（干扰素调节因子-3）可以直接干预干扰素的生成［11］。在机体感染病毒后，干扰素I首先出现应答，这是由于IFN-β的诱导，这个过程受到IRF-3的控制，TBK-1处于IRF-3的上游，激活后可刺激其活性［12］。本研究中发现在EV71手足口病及并发脑炎的患儿中TLR3-TBK1-IRF-3通路的表达水平明显升高，存在时间依赖性，值得注意的是在手足口病脑炎患儿中，该通路的表达水平并未随着发病时间的延长而升高，提示EV71病毒感染对该通路具有抑制作用，与先前的研究保持一致，提示TLR3-TBK1-IRF-3通路参与了EV71手足口病脑炎的发生发展过程。

［1］Tamura F, Chigira A, Ishii H, et al. Assessment of the development of hand and mouth coordination when taking food into the oral cavity. Int J Orofacial Myology,2000,26：33-43.

［2］Hu X M, Zhang Y, Xu B L, et al. Development of a GeXP based multiplex RT-PCR assay for simultaneous differentiation of nine human hand food mouth disease pathogens. Bing Du Xue Bao,2011,27(4)：331-336.

［3］Pan H, Zheng Y X, Mao S H, et al. A case-control study on risk factors that associated with severe hand-foot-mouth disease in Shanghai. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi,2012,33(8)：763-767.

［4］Hiramatsu N, Oze T, Takehara T. Suppression of hepatocellular carcinoma development in hepatitis C patients given interferonbased antiviral therapy. Hepatol Res,2014.

［5］Lu J, Yi L, Zhao J, et al. Enterovirus 71 disrupts interferon signaling by reducing the level of interferon receptor 1. J Virol,2012, 86(7)：3767-3776.

［6］王蓓. EV71拮抗I型干扰素产生的分子机制研究. 北京协和医学院,2013.

［7］Guo F, Mead J, Aliya N, et al. RO 90-7501 enhances TLR3 and RLR agonist induced antiviral response. PLoS One,2012, 7(10)：e42583.

［8］Klein K P, Tan L, Werkman W, et al. The role of Toll-like receptors in regulating the immune response against respiratory syncytial virus. Crit Rev Immunol,2009,29(6)：531-550.

［9］Pang L, Gong X, Liu N, et al. A polymorphism in melanoma differentiation-associated gene 5 may be a risk factor for enterovirus 71 infection. Clin Microbiol Infect,2014.

［10］Ahmed S, Maratha A, Butt A Q, et al. TRIF-mediated TLR3 and TLR4 signaling is negatively regulated by ADAM15. J Immunol, 2013, 190(5)：2217-2228.

［11］Sato S, Sugiyama M, Yamamoto M, et al. Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta(TRIF)associates with TNF receptor-associated factor 6 and TANK-binding kinase 1, and activates two distinct transcription factors, NF-kappa B and IFN-regulatory factor-3, in the Toll-like receptor signaling. J Immunol,2003,171(8)：4304-4310.

［12］Ehrhardt C, Kardinal C, Wurzer W J, et al. Rac1 and PAK1 are upstream of IKK-epsilon and TBK-1 in the viral activation of interferon regulatory factor-3. FEBS Lett,2004,567(2-3)：230-238.

ObjectiveTo investigate the role of TLR3-TBK1-IRF-3 signal pathway in EV71-induced encephalitis of hand food and mouth disease.MethodsThe study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There are 180 members and divided into fi ve groups，each group includes 36. 2day control group（2C），2day hand-food-mouth（2h），5day hand-food-mouth（5h），2day hand-food-mouth and encephalitis（2e），5day hand-food-mouth and encephalitis（5e）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood.ResultsElisa assay：the levels of interferon，TLR3、TBK1、IRF-3、TRIF protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups，（P＜0.01），especially the 5h group，there is no signifi cant difference found between 2e group and 2h group，it is the same between 2e and 5e group.Conclusions the levels of the levels of interferon，TLR3、TBK1、IRF-3、TRIFprotein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but less expression than that groups of general hand food mouth disease，these suggest that TLR3-TBK1-IRF-3 signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省温州市科技局（Y20140501）

温州医科大学附属第二医院（育英儿童医院）