安多霖对高功率微波辐照大鼠睾丸生精细胞Caspase-9和 XIAP的影响

郝述霞 吕慧敏 王春燕 齐雪松 佟 鹏 苟 巧

（中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 北京 100088）

安多霖对高功率微波辐照大鼠睾丸生精细胞Caspase-9和 XIAP的影响

郝述霞 吕慧敏 王春燕 齐雪松 佟 鹏 苟 巧

（中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 北京 100088）

为探讨安多霖对微波辐射损伤的的防治机制，将SD雄性大鼠按质量随机分为正常对照组、辐照组和预防组（给药量分别为3、6、9 mg/kg）。预防组大鼠连续灌胃给药，对照组和辐照组给予双蒸水，20 d后辐照组和预防组大鼠行100 mW/cm2的高功率微波(High power-microwave, HPM)全身辐照10 min。于辐照后第1、2、5天取睾丸组织制备病理标本，采用SP免疫组化检测试剂盒标定目的蛋白，Image-pro plus图像分析软件对特定染色区域进行灰度分析和测定。结果显示，辐照组大鼠睾丸细胞 Caspase-9水平较对照组呈“高−低−高”的“倒抛物线”形(p<0.05)，给药组则随着时间呈现“先低后高”的趋势(p<0.05)；对于X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)而言，辐照组与对照组之间的差异不显著，而6、9 mg/kg组在辐照后第5天较辐照组显著升高(p<0.05)。结果提示，Caspase-9参与了HPM致大鼠睾丸细胞凋亡的过程，安多霖对大鼠睾丸细胞的保护作用需要Caspase-9和XIAP的共同参与。

高功率微波，安多霖，凋亡，Caspase-9，X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)

近年来，国内外学者通过动物实验和流行病学调查对电磁辐射的生物效应开展了不少研究，认为在一定吸收剂量下，电磁辐射对机体的内分泌、心血管、造血、免疫、中枢神经和生殖系统等均可造成损伤，引起组织形态结构改变和功能学障碍等诸多后果[1-6]。目前，针对电磁辐射损伤的辐射防护剂还比较缺乏，中药安多霖是国内自主创新并已获得国家批准的电离辐射防护剂和肿瘤治疗辅助药物。几年来课题组从免疫、生殖和氧化损伤等方面开展了大量实验研究，结果证实，在适宜的剂量下，安多霖对动物免疫系统、氧化应激系统、生殖系统等均有明显保护作用[7-9]。在先前实验基础上，本研究重点考察微波辐射以及服用安多霖对大鼠睾丸细胞凋亡相关蛋白Caspase-9和XIAP的影响，通过研究进一步探讨高功率微波辐射诱导睾丸细胞凋亡及安多霖保护作用的发生机制。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

安多霖由福建阿多拉制药公司提供，为浅黄色粉末，4 ℃保存，给药前用蒸馏水配制。X连锁凋亡抑制蛋白 XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)为美国Sant cruz产品，Caspase-9为Abcam公司产品，免疫组化试剂盒和 DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 动物和分组

实验以SPF级性成熟SD雄性大鼠(250~270 g)为研究对象，按质量随机分为对照组(Control)、辐照组(Exposure)、预防组(Prevention+exposure)（给药剂量为3、6、9 mg/kg），每组10只。预防组大鼠连续灌胃20 d后（对照组和辐照组每天喂双蒸水），将辐照组和预防组大鼠放在自行加工的鼠盒中（大鼠在鼠盒中不能自由活动）采用平均功率密度为100 mW/cm2的高功率微波(High power-microwave, HPM)辐照10 min，分别于辐照后第1、2、5天解剖动物取睾丸，用10%的甲醛溶液固定待用。

1.3 凋亡相关蛋白(XIAP和Caspase-9)表达量的测定

组织切片经脱蜡复水后，用 SP免疫组化检测试剂盒标定目的蛋白。采用Image-pro plus 图像分析软件对动物睾丸免疫组化切片的特定染色区域进行灰度分析。每只大鼠一张切片，每张选取5个视野进行组织的光密度分析。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠睾丸细胞凋亡相关蛋白Caspase-9的变化

安多霖对 HPM辐照大鼠睾丸凋亡相关蛋白Caspase-9的影响见表1。辐照后，辐照组Caspase-9含量较对照组显著升高(p<0.05)，而预防组Caspase-9水平均较辐照组低(p<0.05)。Caspase-9分子以酶原的形式被合成，存在于细胞浆中，在体内低水平表达。活化的Caspase-9与细胞色素C (Cytochrome C)和凋亡蛋白活性因子-1 (Apaf-1 apoptosis protease activating factor-1)一起催化裂解Caspase-3，诱发细胞凋亡。图1显示了各组Caspase-9蛋白的表达量。

表1 安多霖对HPM辐照大鼠睾丸凋亡相关蛋白Caspase-9的影响xTable 1 Effects of Anduolin on Caspase-9 in testicular cells of rats exposed to high power-microwave () (n=10)

表1 安多霖对HPM辐照大鼠睾丸凋亡相关蛋白Caspase-9的影响xTable 1 Effects of Anduolin on Caspase-9 in testicular cells of rats exposed to high power-microwave () (n=10)

注：a与正常对照组比较，p<0.05；b与辐照组比较，p<0.05。Note:a, compared with control group, p<0.05;b, compared with exposure group, p<0.05.

组别Groups照射后不同时间的平均光密度值Average optical density at different times after exposure 1 d 2 d 5 d对照组Control 0.016 2±0.005 4 0.015 0±0.001 9 0.016 1±0.001 9辐照组Exposure 0.022 2±0.005 5a0.005 9±0.001 2a0.022 4±0.003 2a预防组Prevention + exposure 3 mg/kg 0.007 9±0.003 5b0.004 5±0.001 5b0.018 2±0.005 7b6 mg/kg 0.007 9±0.004 7b0.009 9±0.002 9b0.021 2±0.001 2 9 mg/kg 0.015 8±0.002 5b0.013 2±0.001 5b0.019 9±0.001 2b

2.2 大鼠睾丸细胞凋亡相关蛋白XIAP的变化

从表2可知，辐照后的第1天和第2天，辐照组、预防组和对照组之间XIAP的蛋白表达含量没有统计学差异。辐照后第5天，6、9 mg/kg预防组大鼠XIAP蛋白含量较辐照组显著升高(p<0.05)。

凋亡抑制因子XIAP蛋白是一种高度保守的内源性抗细胞凋亡因子，主要通过抑制胱解酶(Caspase)活性和参与调节核因子NF-kB的作用而抑制细胞凋亡。XIAP存在于细胞浆中，长497 kD。图2中显示了各组XIAP蛋白的表达量。

表2 安多霖对HPM辐照大鼠睾丸凋亡相关XIAP的影响xTable 2 Effects of Anduolin on XIAP in testicular cells of rats irradiated by high-power microwave (±s) (n=10)

3 讨论

本课题组先前的研究结果表明，大鼠经 HPM辐照后，其睾丸细胞凋亡明显增加，而安多霖则对HPM辐照大鼠睾丸细胞有保护作用[9]。本研究在以往对多种细胞凋亡相关蛋白研究的基础上，以细胞凋亡相关蛋白Caspase-9和XIAP为指标，进一步探讨 HPM辐照大鼠睾丸细胞凋亡的发生机制，以及探讨中药安多霖对电磁辐射损伤的防治作用及可能机制。

Caspase-9是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个胱解酶。线粒体释放Cyt-c后，Caspase-9可以和Cyt-c以及Apaf-1形成复合物，同时被激活。激活的 Caspase-9可以激活细胞凋亡的最关键酶Caspase-3，从而引起级联反应促进细胞凋亡。在本研究中，辐照组在辐照之后的5 d内Caspase-9表达水平较正常对照组相比较呈“高-低-高”的“倒抛物线”型，辐照后第1天Caspase-9的迅速增高可能是由于辐照组经电磁辐射激发引起，进而引起睾丸细胞凋亡。FANG等[10]用75 mGy（剂量率为12.5 mGy/min）的X射线照射小鼠后24 h，小鼠睾丸细胞 Caspase-9表达水平也升高；辐照后第 2天Caspase-9表达水平锐减，推测可能是由于细胞受损、细胞合成Caspase-9受到限制所致，而第5天由于细胞的损伤修复，Caspase-9含量回升至辐照后第1天的水平，进一步引起细胞凋亡。

对于安多霖药物预防组，辐照之后各给药组在第1、2和5天的Caspase-9含量均比辐照组明显降低(p<0.05)，推测电磁辐射后，给药组动物迅速做出反应使 Caspase-9含量降低以减少睾丸细胞凋亡。同时观察到，在辐照之后的第1天和第2天，随着给药剂量的增大，大鼠睾丸细胞 Caspase-9表达量也增加，而且9 mg/kg组含量在辐照之后各个时间点表达水平比较平稳，推测9 mg/kg组动物由于体内安多霖的药物水平较高，使得在照射之后Caspase-9降低的更早，在辐照后第1天表达已经稳定了，所以在下一步的实验中，我们可以把观察时间提前来验证这一推测。

XIAP是IAP家族中最有效力的内源性Caspase抑制因子，XIAP的BIR3结构域可与Caspase-9单体形成异源二聚体，使 Caspase-9保持单体结构，丧失催化活性[11]。在本研究中，辐照组动物经HPM辐照后，XIAP表达与正常对照组相比没有统计学差异；各预防给药组在辐照后随着时间改变 XIAP表达水平逐步上升，到第5天，6、9 mg/kg组XIAP表达水平明显高于辐照组(p<0.05)。在本实验条件下，HPM辐照对动物睾丸细胞XIAP表达的影响不太明显，而安多霖给药组却显现出其提高XIAP表达水平的作用。Chater等[12]在电离辐射与化疗药物奥沙利铂引起小鼠睾丸细胞凋亡机制的研究中，用0.5 Gy（剂量率为300 cGy/min）的X射线照射小鼠，同样没有引起XIAP水平的变化，而奥沙利铂却可以引起XIAP水平的增高。说明XIAP没有参与非电离辐射和电离辐射所致凋亡这一过程，但安多霖和奥沙利铂却可以调高XIAP的表达来抑制细胞凋亡；安多霖起效时间比较晚，药效维持时间有待于进一步的观察。

结合之前的研究[9,13]，推测HPM辐照大鼠后，睾丸细胞通过一系列的蛋白相互作用，引起p53蛋白的激活，活化的p53由核内向线粒体快速转移，p53或 p53小片段与线粒体膜上表达增高的 Bax[9]相互作用，诱导Bax多聚化形成孔复合物或线粒体肿胀通透性增加导致Cyt-c释放[14-15]。Cyt-c与胞浆中的Apaf-1结合形成凋亡体，并活化Caspase-9，启动细胞凋亡线粒体途径的级联反应，最终导致细胞凋亡。给药组动物虽然也受到某种程度的辐射影响，但其影响较辐照模型组明显减轻，表明安多霖具有辐射防治作用，推测其作用机制是安多霖通过一定程度的逆转Bax和Apaf-1的表达水平、减小线粒体损伤、降低Caspase-3 活性以减少p53的被切割，以及减低Caspase-9和调高XIAP的表达水平，来达到减弱电磁辐射诱导大鼠睾丸细胞凋亡的作用。

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Effects of Anduolin on Caspase-9 and XIAP of testicular cells in rats irradiated by high-power microwave

HAO Shuxia LYU Huimin WANG Chunyan QI Xuesong TONG Peng GOU Qiao
(National Institute for Radiological Protection, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100088, China)

In order to investigate the Anduolin injury prevention mechanism of microwave exposure, sexually matured SD rats were randomly divided into control group, exposure group, and prevention groups (drug dosage were 3, 6 and 9 mg/kg). Prevention groups were given drug continuously by oral administration for 20 d, meanwhile the control group and exposure group were given distilled water. After that the prevention groups and exposure group were exposed to high power-microwave (HPM) of 100 mW/cm2for 10 min. Rats were killed at 1st, 2nd, and 5thday after exposure, and the pathological specimens were prepared from testicular tissue. Interested proteins in testicular tissue were detected with immunohistochemical method, and the protein content were analyzed with image-pro plus analysis software. The results showed that protein content of Caspase-9 of exposure group showed a high-low-high trend compared with control group (p<0.05) at 1st, 2nd, and 5thday after exposed to HPM, while the prevention groupsshowed a trend from low to high with time (p<0.05); for X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) protein, there was no significantly difference between exposure group and control group, while the XIAP levels of 6 mg/kg group and 9 mg/kg group at 5thday after exposure increased significantly compared with the exposure group (p<0.05). The results suggest that Caspase-9 is involved in the HPM-induced apoptosis in rat testis, and protective effect of Anduolin on rat testicular cells requires participation of Caspase-9 and XIAP.

High power microwave, Anduolin, Apoptosis, Caspase-9, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)

HAO Shuxia (female) was born in September 1975 and received her master degree from Chinese Center for Disease Control and Prevention, associate professor, majoring in radiation protection drugs, E-mail: hao-shuxia@163.com

LYU Huimin, professor, E-mail: lu-huimin@163.com

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10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.060201

郝述霞，女，1975年9月出生，2006年于中国疾病预防控制中心获得硕士学位，放射医学专业，副研究员，从事辐射防护药物的研究，E-mail: hao-shuxia@163.com

吕慧敏，研究员，E-mail: lu-huimin@163.com

初稿2016-07-06；修回2016-09-19

Received 6 July 2016; accepted 19 September 2016

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