DC-CTL免疫细胞对4种恶性肿瘤治疗疗效观察

蔡学敏，朱向情，沈丽蓉，赵 晶，何 洁，庞荣清，潘兴华

DC-CTL免疫细胞对4种恶性肿瘤治疗疗效观察

蔡学敏，朱向情，沈丽蓉，赵 晶，何 洁，庞荣清，潘兴华

目的初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对4种恶性肿瘤治疗的临床疗效。方法50例肿瘤患者分为4组，乳腺癌组12例，肺癌组27例，结直肠癌组8例，卵巢癌组3例。分离患者外周血单个核细胞(PBMC)，分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC)，诱导培养细胞达足够数量后回输给患者。分别在治疗前后采用流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和肿瘤标志物的变化，采用主观问卷调查对卡氏行为能力(KPS)进行评分，并对治疗疗效进行评价。结果治疗1个月后，总有效率达82.0%，且未见明显副作用。治疗后1 w，各组外周血CD3、CD4、CD8均显著升高（P＜0.05），而CD4+/CD8+无显著变化；各组外周血NK、CIK和KPS评分均显著升高（P＜0.05），而CEA、FRP、CA19，CA153均较治疗前明显下降（P＜0.05）。结论自体免疫细胞治疗对改善恶性肿瘤患者生活质量，提高患者的免疫功能有明显作用，且安全性好，为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的方向。

树突状细胞；细胞毒T细胞；免疫细胞治疗；疗效

免疫细胞治疗是一种独特的生物治疗技术，可以利用免疫系统中功能最强的抗原递呈细胞树突状细胞(dendritic cell,DC），摄取抗原后，刺激CD8+T细胞和CD4+T细胞活化，增加杀伤活性[1]。我科从2013年获原总后卫生部批准开展免疫细胞治疗临床试验和临床应用，本研究采用自体DC-CTL免疫细胞回输的方法，对50例恶性肿瘤患者进行细胞治疗，对前期治疗效果进行初步总结。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选择本院住院肿瘤患者50例，男18例，女32例，年龄32～77岁。按照患者的肿瘤诊断分为4组，其中乳腺癌组12例，肺癌组27例，结直肠癌组8例，卵巢癌组3例。多为临床上Ⅱ、Ⅲ期分期患者，均接受过化疗，其中乳腺癌组8例做过手术，肺癌组11例做过手术，结直肠癌组4例做过手术，卵巢癌组1例做过手术。在接受本治疗前20 d，终止任何放疗或化疗，并测定外周血T细胞亚群(CD3、CD4、CD8)，检测相关肿瘤标志物，进行影像学、血常规等检查。

1.2 治疗方案 参照原总后卫生部 “军队医院第三类医疗技术临床应用管理办法”开展自体免疫细胞治疗，每例治疗3个疗程，每疗程回输DC细胞数为（1～5）×106个细胞，接连2 d；每次回输细胞毒T淋巴细胞(CTL)数≥1×109，每疗程回输细胞总数＞5×109。

1.3 免疫细胞制备方法[2]无菌采集患者外周血80～100 ml，柠檬酸抗凝30 min。用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用无血清培养基重悬细胞，使细胞密度为2×109个/L，加入细胞培养瓶中。37℃、5%CO2培养箱中培养4 h后弃上清，以37℃预温的培养液RPMI-1640轻洗去除非贴壁细胞，非贴壁细胞倒入另一培养瓶，用无血清培养基AIM-V调整细胞密度为1×109个/L，进行CTL细胞的诱导。同时用无菌细胞刮刮取贴壁的黏附细胞，再以无血清培养基AIM-V调整细胞密度为1×109个/L。

1.3.1 DC细胞的体外诱导 （1）向黏附细胞悬液中加入rhGM-CSF和rhIL-4，细胞因子的应用浓度均为50 μg/L，进行DC诱导培养：隔天进行半量换液，补充细胞因子，培养5 d后加入TNF-a，浓度均为50 μg/L，继续培养2 d。（2）在诱导DC的过程中，每天于倒置显微镜下观察细胞形态。（3）7 d后收集悬浮的细胞，用无菌生理盐水洗涤3次，1500 r/min离心10 min，去掉上清，细胞悬于20 ml生理盐水中，显微镜下计数，细胞数应大于107。检查无菌、无其他污染后，对患者进行细胞回输治疗，同时可分析DC的表型及功能。

1.3.2 CTL细胞的诱导 （1）向未贴壁细胞悬液中加入INF-γ，细胞因子的应用浓度为2000 U/ml，培养24 h。（2）加入rhIL-2浓度为2000 U/ml，PHA浓度为40 μg/ml，CD3单抗浓度为100 ng/ml，隔天进行半量换液，补充细胞因子，培养到第8 d。（3）收集细胞，用无菌生理盐水洗涤3次，1500 r/min离心10 min，去掉上清，细胞悬于20 ml生理盐水中，显微镜下计数，细胞数应大于109。检查无菌、无其他污染后，对患者进行细胞回输治疗。

1.4 观察指标 分别在治疗前和治疗后1 w，采用流式细胞术检测患者外周血CD3+、CD4+、CD8+水平和肿瘤标志物，并采用主观问卷调查对卡氏行为能力(KPS)进行评分。

1.5 疗效评定 治疗结束后1个月，参照WHO实体肿瘤疗效评定标准：完全缓解(CR)：所有可见病变完全消失并至少维持 4 w；部分缓解(PR)：肿瘤基线病灶长径总和缩小30%；稳定(SD)：肿瘤基线病灶长径总和有缩小但未达PR，或有增加但未达PD；进展(PD)：肿瘤基线病灶长径总和增加 20%或出现新病灶。有效率=[(CR例数+PR例数)/总例数]×100%。

1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料组间比较采用配对t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组临床疗效比较［n(%）］

2 结果

2.1 临床治疗效果 治疗总有效率达82.0%（表1），观察期间未见明显毒副作用，仅2例输入细胞后出现低热，体温38℃，2 h后自行缓解。

2.2 治疗前后各组相关检测指标的变化 治疗后1 w，各组外周血CD3+、CD4+、CD8+均显著升高（P＜0.05），而CD4+/CD8+无显著变化（P＞0.05），见表2。

治疗后1 w，各治疗组外周血NK、CIK和KPS评分均显著升高（P＜0.05，表3）。

治疗后1 w，各组CEA、FRP、CA19，CA153均较治疗前明显下降（P＜0.05，表4）。

3 讨论

肿瘤已经是威胁我国人民生命的主要疾病，全国每年新增肿瘤患者约220万，每年约有180万人死于肿瘤，占总死亡人数的1/5，占总死因的第2位，在城市占第1位[3]。

DC-CTL细胞过继免疫治疗就是通过抽取、分离患者外周血中的单个核细胞，在体外添加特异组合的细胞因子及单克隆抗体进行诱导培养，获取大量有抗肿瘤活性DC和CIK细胞，并可分泌多种有抗肿瘤活性细胞因子，回输到体内后达到直接杀伤体内残余肿瘤细胞，预防复发、转移及提高患者机体免疫功能，并可产生免疫记忆保护，达到更长久的抗肿瘤效果[4]。DC-CTL细胞治疗肿瘤安全有效，特别是对于手术后的肿瘤患者，对清除残留微小的转移病灶、防止癌细胞的扩散和复发、提高患者自身免疫力等具有重要作用。对于已扩散转移、无法承受手术、放疗、化疗的严重肿瘤患者，也可单独使用免疫疗法或联合使用免疫疗法，可以大大提高患者的承受能力及提高化疗、放疗的疗效，降低放疗、化疗的毒副作用，减轻痛苦，提高患者的生存质量[5]。

表2 各组治疗前后外周血T细胞的变化

表3 各组治疗前后外周血免疫细胞和KPS评分变化

表4 各组治疗前后外周血肿瘤标志物的变化

本研究对本院住院50例恶性肿瘤患者进行免疫细胞治疗，治疗后，患者的KPS评分有显著提高，患者生活质量均有改善，精神状态好转。淋巴细胞免疫功能分析，CD4+、CD8+细胞比例和数量增加，免疫功能明显改善。从目前的疗效来看，手术、放疗、化疗后的患者，肿瘤负荷较小，相对效果更好。对于肿瘤Ⅳ期的患者，由于肿瘤负荷较大，自身免疫功能低下，细胞活性不高，相对治疗效果较差，但对生活质量的提高及延长生命有一定作用。因此，免疫细胞治疗应该积极配合其他传统治疗，对肿瘤采取综合治疗的手段，疗效更佳[6]。

另外免疫细胞治疗相对安全，无毒副作用，仅2例输入细胞后出现低热（38℃），2 h后自行缓解。但目前DC-CTL细胞治疗也面临着一些问题，例如如何提高DC细胞抗原靶向性；肿瘤细胞免疫逃逸的机制复杂，有时DC细胞难以捕获有效抗原；此外DC细胞的诱导效率低，也是免疫细胞治疗的瓶颈问题。现在有许多直接转入相关的肿瘤抗原基因到DC的方法进行尝试，也有在DC细胞中转入IL-12的基因[7]，加强抗原提呈的效果，也取得了一定的成效，但仍需进一步的深入研究。

[1] Kawakami Y.Cancer treatment by comprehensive regulation of anti-tumor immune network[J].Nippon Rinsho,2010,68(6):1094-1099.

[2] 蔡学敏 ，朱向情，刘凌，等.人外周血树突状细胞的诱导、鉴定及活性测定[J].中华细胞与干细胞杂志(电子版),2012，2(4): 231-236.

[3] 陈万青，郑荣寿，曾红梅,等.2011年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2015,24(1):1-10.

[4] Wang X,Yu W,Li H,et al.Can the dual-functional capability of CIK cells be used to improve antitumor effects[J]?Cell Immunol, 2014,287:18-22.

[5] Pan K，Wang QJ，Liu Q，et al．The phenotype of exvivo generated cytokine-induced killer cells is associated with overall survival in patients with cancer[J]．Tumour Biol，2014，35(1):701-707.

[6] Chenhong Zheng,Ganjun Yu,Hui Wang,et al.Meta-analysis of chemotherapy and dendritic cells with cytokine-induced killer cells in the treatment of non-small-cell lung cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(8):14527-14537.

[7] Zhu H,Yang X,Li J,et al.Immune response,safety,and survival and quality of life outcomes for advanced olorectal cancer patients treated with dendritic cell vaccine and cytokine-induced killer cell therapy[J].Biomed Res Int,2014, 603871-603875.

Efficacy of DC-CTL immunological cells on treatment of four malignant tumors

Cai Xuemin,Zhu Xiangqing,Shen Lirong,Zhao Jing,He Jie,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming, Yunnan,650032,China

Objective To preliminarily observe the efficacy of autologous DC-CTL immunological cell infusion on the treatment of four malignant tumors.MethodsA total of 50 tumor patients were divided into four groups:the breast cancer group (n=12),the lung cancer group(n=27),the colorectal cancer group(n=8)and the ovarian cancer group(n=3).The peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of the patients were separated for respective induced culture of CTLs and dendritic cells(DCs).The cells thus cultured were infused to the patients when the number of such cells was adequate.The changes of CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+and tumor markers in peripheral blood lymphocyte (PBLs)of the patients were detected by flow cytometry before and after the treatment. Subjective questionnaire was conducted to score the KPS and evaluate the efficacy.ResultsOne month after the treatment,the ORR reached 82.0%without any obvious side effects.One week after the treatment,the CD3,CD4 and CD8 in the peripheral blood(PB)in all groups increased significantly(P＜0.05),while CD4+/CD8+showed no obvious change;the scores pf NK,CIK and KPS in the PB in all groups increased greatly(P＜0.05),while CEA,FRP,CA19 and CA153 were much lower than those before the treatment(P＜0.05).ConclusionAutologous immune cell therapy is significantly effective and highly safe on the improvement of the quality of life of tumor patients and their immunologic function,providing a new direction for the treatment of malignant tumors.

DC;CTL;immune cell therapy;efficacy

R 318.1/730.5

A

1004-0188（2016）12-1371-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.006

2016-07-05)

国家科技支撑计划项目（2014BI01B0）；国家973计划项目（2012CB5181060）；云南省科技计划重点项目(2013CA005）

650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

潘兴华，E-mail:xinghuapan@aliyun.com;庞荣清,E-mail: pangrq2000@aliyun.com