黑麦多酚提取工艺及体外清除亚硝酸盐研究

郝教敏 杨文平 李红玉 杨珍平 韩雪梅

黑麦多酚提取工艺及体外清除亚硝酸盐研究

郝教敏1杨文平2李红玉3杨珍平4韩雪梅1

（山西农业大学食品科学与工程学院1，太谷 030801）
（华北理工大学生命科学学院2，唐山 063000）
（山西农业大学科技处3，太谷 030801）
（山西农业大学农学院4，太谷 030801）

为优化黑麦多酚提取工艺，并评价其体外清除亚硝酸盐能力，试验比较了水和乙醇对黑麦多酚得率的影响，确定乙醇为提取剂；进一步采用单因素试验和三元二次正交试验，分析乙醇浓度、乙醇用量、提取温度、提取时间对黑麦多酚得率的影响并优化工艺参数；最后对黑麦多酚体外清除亚硝酸盐能力进行测定。结果表明，体积分数50%乙醇溶液提取黑麦多酚的最优工艺参数为：乙醇用量59 mL（即料液比1∶11.8），54℃水浴48 min，得率2.10 mg／g；三因素对黑麦多酚得率的主效应是乙醇用量（X3）＞提取温度（X1）＞提取时间（X2）；交互效应为X1X3＞X2X3＞X1X2；黑麦多酚具有较强的清除亚硝酸盐能力，当提取液用量超过5 mL时，清除率可达84%以上。

黑麦 黑麦多酚 提取工艺 亚硝酸盐 清除率

天然植物抗氧化剂相比人工合成的抗氧化剂更安全、健康和无毒，已引起人们的广泛关注并成为当今食品科学发展的必然趋势。植物多酚是植物体内复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构［1］，是一类具有独特生理活性和药理活性的天然产物，主要存在于植物的皮、根、茎、叶和果实中。研究表明，植物多酚具有抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗癌、抑菌、抑制心脑血管疾病等生物活性功能［2-4］，对清除亚硝酸盐也有一定的作用［5］，在食品、制药、生化及日化等领域具有广阔的应用前景。黑麦又称裸麦、黑小麦，为禾本科黑麦属1年生草本植物，富含淀粉、膳食纤维（可达13%～19%）［6］、脂肪、蛋白质、B 族维生素和磷、钾等多种重要营养素及多种生物活性物质［7-8］，

具有较高的营养价值和保健作用，开发和利用潜力较大。但有关黑麦多酚的提取工艺及清除亚硝酸盐能力的研究甚少。本研究采用水浴浸提法，通过单因素试验和三元二次正交试验分析了黑麦多酚提取的主要影响因素，并优化了提取的工艺条件，同时，考察了黑麦多酚清除亚硝酸盐的能力。为黑麦深加工及黑麦多酚的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 试验原料

黑麦（Secale cereale L.，禾本科，黑麦属）籽粒，引自加拿大的“黑引1号”品种，由山西农业大学农学院提供。

1.1.2 试剂

无水碳酸钠、无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；水合没食子酸：成都市科龙化工试剂厂；福林酚、对氨基苯磺酸、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠等均为分析纯。

1.1.3 仪器

FZ102微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；721可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；TDL-4离心机：上海安亭科技仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

将去杂去劣筛选干净的黑麦籽粒，按一定的比例加水润湿，一段时间后，用植物组织粉碎机按14%出麸率进行粉碎，过筛，风干。将风干后的黑麦粉收入容器中，避光低温保存备用。

1.2.2 没食子酸标准曲线的绘制

准确称取水合没食子酸40 mg，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，移入棕色瓶。再从棕色瓶中吸取10 mL，定容到100 mL，得质量浓度0.040 mg／mL 的没食子酸标准使用溶液。分别吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 没食子酸标准使用溶液于25 mL比色管中，各管分别加蒸馏水至3.5 mL，再分别加入1 mL福林酚试剂，静置3 min，用5%（m／V）碳酸钠溶液定容至刻度25 mL，摇匀，静置15 min（避光）后，以0.0管的溶液为空白，于765 nm处测定吸光值。以吸光度值为横坐标，没食子酸的质量为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 黑麦多酚的提取和测定

准确称取黑麦粉5.0 g，按一定料液比加入提取剂，于一定温度下水浴浸提一定时间，室温下静置28 h，过滤，得浸提液。取浸提液1 mL于25 mL比色管中，然后按照标准曲线的绘制方法，以不加浸提液的空白处理作参比，于765 nm处测定吸光值。查标准曲线获得浸提液中没食子酸的毫克数，按照公式计算黑麦多酚得率（mg／g）。

黑麦多酚得率＝提取液中没食子酸的质量／mg／样品的质量／g

1.2.4 试验设计

1.2.4.1 提取剂选择

准确称取5.0 g黑麦粉10份，分别装入10个干净的锥形瓶内，其中5个瓶内依次加入体积分数为50%乙醇溶液40、50、60、70、80 mL；其余5 个瓶内分别加入相应体积的蒸馏水，40℃水浴30 min后取出，静置，过滤，后续步骤参照1.2.3操作。重复3次。

1.2.4.2 单因素试验及三元二次正交回归设计

根据1.2.4.1的试验结果，选择乙醇为提取剂，设乙醇体积分数（%）、乙醇用量（mL）、浸提温度（℃）及浸提时间（min）4个单因素试验（表1）。依单因素试验结果，确定3个主要影响因素，采用三元二次正交回归设计优化提取工艺。同时将正交组合中获得的最大浓度黑麦多酚粗提液，稀释100倍待用。

1.2.5 亚硝酸盐清除率测定

采用对氨基苯磺酸盐酸萘乙二胺分光光度法。准确量取2份5μg／mL亚硝酸钠标准使用溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中；1份作空白对照，1份加入一定量的黑麦多酚稀释液，摇匀，反应一定时间；然后分别加入0.4%对氨基苯磺酸溶液2 mL，摇匀，静置5 min；再分别加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容至刻度线，静置15 min；以蒸馏水作参比，于540 nm处测得吸光度。

亚硝酸盐清除率＝［（A2-A1）／A2］×100%

式中：A1为黑麦多酚稀释液与2%亚硝酸钠溶液的混合液的吸光度值；A2为空白对照的吸光度值。

1.3 数理统计与分析方法

对所得数据用Excel软件整理制表，用Sigma-Plot10.0绘图软件制图，用SAS9.1.3 统计分析软件进行方差分析、Duncan＇s多重比较、RSREG回归分析、G3D过程分析等。

2 结果与分析

2.1 水提取剂与50%乙醇提取剂对黑麦多酚提取效果的影响

由图1可以看出，在同一料液比下，50%乙醇提取的黑麦多酚得率更高。说明黑麦多酚得率与溶剂的极性有关，可能的原因是多酚在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂具有氢键断裂的作用，因此乙醇溶剂更利于黑麦多酚的溶出。故选择乙醇提取剂进行后续单因素试验。

表1 单因素试验设计

图1 提取剂对黑麦多酚得率的影响

2.2 单因素试验结果分析

由图2可以看出，4个单因素对黑麦多酚得率均有显著的影响（P＜0.05），且除浸提温度外均符合开口向下的抛物线模型。其中，50%乙醇溶液提取的黑麦多酚得率最高，这可能与黑麦多酚所携带的酚羟基（-OH）数量有关，数量越多，极性越强。当乙醇浓度较高时，提取剂以乙醇相为主，极性较强；当乙醇浓度较低时，提取剂以水相为主，极性较弱，这2种情况下可能均难以将黑麦多酚完全浸提出来。当50%乙醇溶液的用量达到60 mL（即料液比1∶12）时，黑麦多酚得率最大，表明样品中的多酚可能已完全分布到提取剂中；继续提高乙醇溶液用量，反而抑制了黑麦多酚在溶剂中的分散溶出。在20～50℃范围内，随着温度升高，多酚得率呈明显上升趋势（P＜0.05），这是由于温度升高，分子运动加速，氢键更易断裂，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，因而酚类物质更易于从原料中溶出［9-10］；当温度达到60℃，溶剂蒸发加快，在一定程度上抑制了多酚的溶解；进一步提高温度，伴随溶剂的快速蒸发，发生淀粉糊化、蛋白质变性、多糖等物质溶出生成胶体物质等，导致提取液浑浊度增加，吸光值陡升。在前3个因素选择确定的基础上，以浸提50 min时黑麦多酚得率最大，表明此时黑麦多酚已全部溶出；继续延长浸提时间，可能会引起多酚类物质分解氧化等［6］。

图2 各因素对黑麦多酚得率的影响

2.3 正交回归试验结果分析

根据单因素试验结果，确定乙醇体积分数为50%，进一步采用三元二次正交设计（表2），分析提取温度（X1）、提取时间（X2）、乙醇用量（X3）及其交互作用对黑麦多酚得率的影响，以获得最佳工艺。

表2 三元二次正交设计的因素水平编码、试验组别及试验结果（n＝3）

采用SAS9.1.3软件RSREG过程对表2三因素编码水平与多酚得率指标进行Y＝B0+∑BjXj+∑BijXiXj+∑BjjX2j的回归分析，得多酚得率指标（Y）对试验因素X1～X3编码间的回归方程：

对回归模型（1）进行方差分析与F检验可知，F拟合＝89.89（P ＜0.000 1），达到极显著水平；回归方程的决定系数R2＝0.992 6，说明模型方程差异显著，且拟合较好。因此可以用该模型分析各工艺参数对黑麦多酚得率的影响。

对回归模型（1）的偏回归系数进行显著性检验表明，三因素的的一次项、二次项及交互项对多酚得率的影响均达到极显著水平（P＜0.001），其中二次项（Xj2）均为负效应，再次表明三因素对多酚得率的影响均符合开口向下的抛物线模型。

对三因素主效应作显著性检验表明，三因素对多酚得率的影响均达到极显著水平（P＜0.001），且作用顺序依次为乙醇用量＞提取温度＞提取时间。

采用降维法将式（1）中的某一因子Xj固定在“0”编码水平，获得多酚得率与另外两因子的偏回归模型见式（2）、式（3）、式（4）。

通过SAS软件的G3D过程分析得出，水浴醇提黑麦多酚时，提取温度的作用大于提取时间的作用；乙醇用量的作用大于提取温度的作用，也大于浸提时间的作用。当温度较低、时间较短时，提高温度，延长时间，有利于加快分子运动，促进多酚物质充分溶出，多酚得率提高；当温度较低、乙醇用量较少时，适当提高温度，加大乙醇用量，有利于促进多酚物质向溶剂溶出、扩散；当这些因素达到一定程度后，继续提高温度，延长时间，或增加溶剂用量，反而会降低多酚得率。

由SAS软件RSREG过程中三因素典型性分析结果可知，提取温度（X1）、提取时间（X2）和乙醇用量（X3）分别为54℃（对应编码值0.358）、48 min（对应编码值-0.072）和59 mL（对应编码值-0.024）时，黑麦多酚得率最大，值为2.10 mg／g。经实测验证该最佳工艺的提取得率为2.09 mg／g，标准偏差为0.007。所以该模型较好地反映了各因素对黑麦多酚得率的影响。

2.4 黑麦多酚对亚硝酸盐的清除能力分析

将正交组合中获得的最大浓度黑麦多酚粗提液（0.244 mg／mL）稀释100 倍后，进行亚硝酸盐清除能力测定（图3）。结果表明，黑麦多酚稀释液对亚硝酸盐具有明显的清除作用（P＜0.05）；当其用量为5 mL时，清除率达84.30%；继续增加用量，对亚硝酸盐清除率变化不大，这可能是由于黑麦多酚与亚硝酸盐之间的反应已达到相对饱和状态所致。

图3 黑麦多酚对亚硝酸盐的清除能力

3 讨论

3.1 黑麦多酚水浴浸提工艺探讨

水浴浸提法提取植物多酚，常用的溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮，考虑到甲醇和丙酮的毒性较大，所以本研究仅比较了水和乙醇溶液的多酚提取效果，并确定乙醇溶液为提取剂。根据多酚来源不同，浸提剂种类及浓度、浸提温度及时间等提取条件和主要影响因素均有所不同［11-13］。本研究结果表明，影响黑麦多酚得率的主效应是乙醇用量＞提取温度＞提取时间，而且三因素之间亦存在明显的互作效应。当50%乙醇用量、提取温度、提取时间的最适条件分别为59 mL（即料液比1∶11.8）、54 ℃、48 min 时，多酚得率最大（2.10 mg／g）。乙醇溶剂提取多酚，操作简单易行，提取率相对较高，所得产品更安全，成本较低，因此可进行工业化生产。

3.2 黑麦多酚清除亚硝酸盐能力及其物质组成探讨

亚硝酸盐是生成亚硝胺的前体物质，而亚硝胺（也称N-亚硝基化合物）具有强致癌性［14］，故亚硝酸盐的存在危害人体的健康。据资料表明，上市的各类熟肉制品的合格率平均仅为60.4%～87.0%，添加天然无毒的物质清除亚硝酸盐已成为当今一个热门研究课题［15］。Tsai等［16］和Huang 等［17］研究表明绿茶、中草药、红薯叶提取物都具有清除亚硝酸盐的作用。本研究结果显示，黑麦多酚具有较强的清除亚硝酸盐能力，且随着用量的增加清除率增大。前人研究表明，黑麦中含有阿魏酸、黄酮、烷基间苯二酚、木质素（也叫木酚素）、植物甾醇类等生理活性物质［7-8，18］，其中的阿魏酸对于过氧化氢、超氧自由基、羟基自由基、过氧化亚硝基具有强烈的清除作用［19-20］；烷基间苯二酚（ARs）仅麦类中含量较高，能够清除自由基和抗脂质氧化；木质素分子中常含有醇羟基、酚羟基、甲氧基、亚甲二氧基、羧基及内酯等基团，因而也具有这些功能基团的性质和反应。此外，黑麦多酚中还包含生育酚、麦黄酮等。本文作者通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-C18柱），也初步判断黑麦多酚包含有阿魏酸、绿原酸、麦黄酮等物质成分。因此，后续研究将着重于黑麦多酚物质成分的定性及定量检测。

4 结论

黑麦多酚水浴浸提的最佳工艺参数为：乙醇体积分数50%、料液比1∶11.8、54 ℃水浴48 min，多酚得率2.10 mg／g。经实测验证该最佳工艺的多酚得率为2.09 mg／g，标准偏差为0.007。黑麦多酚提取液对亚硝酸盐有明显的清除作用，随着多酚用量的增加，清除率快速增加，可达84%以上。

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Extraction Process of Rye Polyphenols and Its Scavenging Capability to Nitrite in vitro

Hao Jiaomin1Yang Wenping2Li Hongyu3Yang Zhenping4Han Xuemei1
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801）
（College of Life Science，North China University of Science and Technology2，Tangshan 063000）
（Department of Science and Technology，Shanxi Agricultural University3，Taigu 030801）
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University4，Taigu 030801）

In order to optimize the extraction process of rye polyphenols and to evaluate scavenging capability to nitrite in vitro，ethanol was ascertained as an extracting solvent by comparing the effects of distilled water with ethanol on the extraction yield of rye polyphenols.Then，single-factor experiment and ternary quadratic orthogonal design were adopted to analyze the effects of ethanol concentration，ethanol volume，extraction temperature and extraction time on the yield of rye polyphenols and to optimize extraction process parameters.In final，the scavenging rate of rye polyphenols to nitrite in vitro was determined.Results showed that optimum process parameters of 50%ethanol-water solution extracting rye polyphenols were as followed：ethanol volume 59 mL （i.e.，the ratio of material and solvent was1∶11.8），extracted in the water bath for 48 min at 54 ℃，and the yield of rye polyphenols was2.10 mg／g.The major effects of three factors on the yield of rye polyphenols were ethanol volume（X3）＞extraction temperature（X1）＞extraction time（X2），the mutual effects between two factors were X1X3＞X2X3＞X1X2.Rye polyphenols had a stronger scavenging capacity to nitrite，and the scavenging rate reached above 84%when the dosage of extracting solution was more than 5 mL.

Rye（Secale cereale L.），rye polyphenols，extraction process，nitrite，scavenging rate

S512.5；TS21

A

1003-0174（2016）11-0118-06

山西省科技攻关（20110311001-4），山西农业大学校育种基金（2014yz2-8）

2015-01-28

郝教敏，男，1974年出生，副教授，天然植物活性成分在肉制品中的应用

杨珍平，女，1973年出生，教授，植物资源学及植物生理生态