影响核桃油包水乳液物理与氧化稳定性的因素分析

易建华 孙艺飞 朱振宝 董文宾 黄 鑫

影响核桃油包水乳液物理与氧化稳定性的因素分析

易建华1孙艺飞1朱振宝1董文宾1黄 鑫2

（陕西科技大学食品与生物工程学院1，西安 710021）
（焦作市粮油质量安全检测中心2，焦作 454003）

以核桃油为油相，以聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）为表面活性剂，制备油包水（W／O）乳液，乳液于55℃避光保存，每隔1 d测定乳液液滴的平均粒径及粒径分布等物理特性，同时检测乳液初级氧化产物—脂质氢过氧化物与次级氧化产物—己醛，探究水油界面与表面活性剂用量对W／O乳液稳定性影响。结果表明，在W／O乳液，油水界面存在加速乳液脂质氧化，降低了乳液氧化稳定性。0.3%～1.0%PGPR，表面活性剂含量增大显著降低乳液液滴粒径，提高乳液物理稳定性；同时，表面活性剂含量增加显著推迟了初级与次级产物形成延迟期，提升了乳液脂质氧化稳定性。W／O体系中过量表面活性剂与脂质氢过氧化物相互作用，增加了脂质氢过氧化物在油相的浓度，并降低了该初级氧化物的分解速率。

油水界面 油包水乳液 油脂氧化 表面活性剂

脂质氧化导致食品品质包括味觉、质地、保质期、外观和营养价值等劣变［1］。在某些食品中（例如干酪、腊肉、火腿等），有限的脂质氧化赋予食品特殊的风味［2］。但是，在大多数食品中，脂质氧化产生异味，并生成具有潜在毒性的反应产物［3］，因此，脂质氧化应尽量避免。近年来临床医学研究发现摄入适量的多不饱和脂肪酸PUFA（如ω-3、ω-6系列不饱和脂肪酸）对人体健康有益［4］。但PUFA极易氧化，这种特性制约了不饱和脂肪酸在食品中的应用。

油脂一般以水包油（O／W）乳液或者油包水（W／O）乳液形式存在于食品体系，其中，O／W 乳液是油脂存在于食品的主要形式，近几十年对油脂氧化稳定性的研究也多集中于该体系［5］。现已证实，由于水油界面的存在加速了油脂与水相促氧化剂相互作用，导致油脂在O／W体系的氧化稳定性低于纯油体系。目前，相关学者专家指出，不饱和油脂氧化形成的脂质氢过氧化物具有表面活性，该氢过氧化物主要定位于油水界面，并与水相促氧化剂如过渡金属离子相互作用，形成高活性烷氧自由基，该自由基重新攻击未氧化的不饱和脂肪酸，从而加速油脂氧化［6］。

油水具有不同的密度，因此，乳状液倾向分离成油层（低密度层）于水层（高密度层）之上的体系，以减少油水接触面积［7］。为制备在一定时间内（数周、数月或数年）动力学相对稳定的乳状液，乳液在均质时需使用乳化剂。在均质化过程中，乳化剂吸附到油水界面，促使液滴进一步微细化，形成一层保护膜，防止液滴的聚集。在食品工业中最常用的乳化剂有两性蛋白质、磷脂和小分子表面活性剂。通过乳化剂形成的界面膜，其特性对乳液脂质氧化的速率具有很大的影响。因此，食品科学家常通过使用不同的乳化剂来操纵界面膜特性，以提高乳液的氧化稳定性。然而，乳液均质化后，有显著数量的非吸附性表面活性剂分子存在于O／W乳液水相，超过其临界胶束浓度（CMC），未吸附的表面活性剂形成胶束。胶束是表面活性剂分子的聚集体，其中，非极性尾部朝内，极性头部朝外。表面活性剂胶束能把非极性分子引入疏水核心，把极性或两性分子引入表面活性剂围成的栅栏层中。因此，胶束能够溶解脂类、抗氧化剂或促氧化剂，改变体系的氧化稳定性［8］。现研究证实，表面活性剂胶束与降低O／W乳液的脂质氧化速率，其潜在机制在于表面活性剂胶束能降低促氧化剂活性或促使脂质氢过氧化物从油核转移至连续相［9］。

W／O乳液（如黄油、人造奶油）是油脂存在于食品的重要形式。基于油水界面以及表面活性剂浓度对O／W乳液脂质氧化稳定性影响，本课题以富含PUFA核桃油为原料，重点研究上述因素对W／O体系脂质氧化速率是否也存在影响，并阐明其机理，以期为含PUFA油脂（如核桃油、亚麻籽油）应用于W／O食品乳液提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

核桃油：自制。

异丙苯过氧化氢，十六烷，氯化钡，氯化钠，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，正己烷，甲醇，正丁醇，孟加拉红：西格玛化学试剂有限公司；聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR，4175）：美国Palsgaard。所有试剂为分析纯。

1.2 设备与仪器

M133／1281-0便携式均质搅拌器：美国Biospec Products有限公司；ECLIPSE80i光学显微镜：尼康机械有限公司；WX Ultra 80超高速离心机：美国Thermo scientific公司；粒径动态激光散射仪：美国马尔文机械有限公司；高压微射流均质机：美国Microfluidics公司；GC-17A气相色谱：日本Shimadzu公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳液的制备和储存条件

前期试验研究表明，乳液中表面活性剂PGPR质量分数为0.3%时，可获得稳定的乳状液体系，因此，采用核桃油与0.3%PGPR混合制备油相。2%水相（20 mmol／L pH 3.0的磷酸盐缓冲液）逐渐滴加于油相，由便携式均质搅拌器以2 000 r／min搅拌2 min，获得粗乳液，随后用微射流均质机以120 MPa压力均质3次，获得W／O乳液。制备的乳液样品转移至10 mL GC小瓶，垫片采用聚四氟乙烯／硅氧烷复合材料，并用铝盖密封，样品于55℃恒温室避光保存。每天取不同处理3瓶样品，检测脂质氢过氧化物和己醛的形成。研究乳化剂（表面活性剂）用量对W／O乳液氧化稳定性影响的试验，制备乳液时，加入的乳化剂PGPR占乳液质量分数分别为0.3%、0.5%、1.0%，所有乳液制备参照上述方法。

1.3.2 乳液物理性质的测定

分析前轻轻搅拌乳液，以确保乳液体系中水滴均匀分散。滴加乳液于载玻片，加盖盖玻片。利用光学显微镜观察乳液结构，该显微镜连接数字图像处理软件CCD照相机，可动态获取乳液液滴分布的图像资料。采用粒径动态激光散射仪于25℃测定水滴粒径，测定方法参照Choi等［10］试验方法，具体方法：乳液样品用十六烷稀释到4倍，（十六烷折射率1.434，黏度为3.13 mN s／m2），混合均匀，并立即转移至3 mL激光散射玻璃皿，测定乳液液滴粒径的大小。微滴大小为散射强度加权平均直径，以z-average表示。每处理重复3次，在室温下测定样品。

1.3.3 脂质氧化物的测定

1.3.3.1 脂质氢过氧化物的测定

脂质氧化初级产物以脂质氢过氧化物含量表示。依据Panya等［11］测定脂质氢过氧化物的方法，并做一些改进：20μL乳状液称重，并添加于2.8 mL甲醇／正丁醇混合液中（甲醇／正丁醇＝2∶1，V／V），然后加入15μL 3.94 mol／L硫氰酸铵和15μL亚铁溶液（由0.132 mol／L 氯化钡和0.144 mol／L 硫酸亚铁配制）。混合液旋涡混合，置于室温下反应20 min后，用分光光度计于510 nm处测定吸光度。以过氧化枯烯（异丙苯过氧化氢）为标准品绘制标准曲线，并计算出氢过氧化物的含量。

1.3.3.2 己醛测定

脂质氧化次级产物以顶隙己醛含量表示。根据Panya等［11］的方法，采用GC-17A气相色谱测定己醛浓度：将以聚四氟乙烯／硅氧烷为密封垫并用铝盖加盖的玻璃瓶中的1 mL样品加热到55℃保持8 min。气相色谱分析条件固相：50／30 μmol／L DVB／Carboxen／PDMS；色谱柱：Supelco DB-1 柱，30 m ×0.32 mm。载气为氦气，流速为15 mL／min。纤维针注入小瓶，吸取挥发物2 min，然后转移到喷油器端口（250℃），注射3 min。注射端口是按照分流模式操作，分流比为1∶7。检测器：火焰电离检测器，检测温度250℃。以己醛标准品绘制标准曲线，采用峰面积计算己醛含量。

1.3.4 脂质氢过氧化物的制备

脂质氢过氧化物制备前，采用Panya等［11］试验方法对核桃油进行脱极性处理，以除去核桃油自身含有的脂质氢过氧化物以及游离脂肪酸等极性成分。脂质氢过氧化物制备依照Nuchi等［9］的方法，有所改动，具体方法：50 mg单线氧发生剂孟加拉红与10 g脱极性核桃油混合。混合油脂置于4℃下，用90 W白炽灯照射12 h，制备脂质氢过氧化物，其浓度大约为0.2 mmol／g油。顶空己醛检测显示未有己醛产生，表明脂质氢过氧化物尚未分解。

1.3.5 脂质氢过氧化物油相分布测定

分别将0.3%、0.5%、1.0%PGPR 加入中碳链脂肪酸酯（MCT），制备油相。MCT具有高度的氧化稳定性，在试验期间不会氧化降解生成脂质氢氧化产物，因此采用MCT替代核桃油进行脂质氢过氧化物油相分布测定试验。按照1.3.4方法制备过氧化脂，将2.0%（质量分数）水相加入含不同浓度的PGPR混合油相中。将EDTA（50μmol／L）加入水相以防止乳液脂质氢过氧化物的分解。含脂质氢过氧化物的乳液制备采用1.3.1方法。乳液于室温搅拌1 h，5 g乳液于4 ℃下46 000 r／min 离心30 min，移取0.2 g连续相，测定氢过氧化物的浓度，同时测定相未分离前乳液的脂质氢过氧化物的浓度。

1.3.6 脂质氢过氧化物分解测定

采用硫酸亚铁加速氢过氧化物分解，具体方法如下：采用1.3.1方法制备分别含质量分数0.3%、0.5%、1.0%PGPR 的MCT 油相，将过氧化脂（含乳液质量分数2.0%）加入上述含不同PGPR浓度的混合脂质相；于水相加入0.2 mmol／L硫酸亚铁取代EDTA；制备乳液。乳液在室温下搅拌平衡1 h，之后每1 h测定氢过氧化物浓度，连续测定6 h。未添加硫酸亚铁乳液作为空白对照。

1.3.7 统计分析方法

每个样品重复测定3次，取平均值，数据结果以均值±标准差表示，采用Microsoft excel软件绘图，并运用Duncan＇s多重比较进行显著性检验（P＜0.05）。脂质氧化滞后期或延迟期定义为第1个数据点显著大于0 d氧化指标值。

2 结果与分析

2.1 乳液物理稳定性及影响因素

乳液制备后立即测定乳液液滴粒径，并在储藏过程中每1 d测定1次。乳液水滴平均粒径（z-average）为（319.6 ±16.7）nm，试验中发现除表面活性剂浓度对乳液液滴粒径分布和平均粒径有明显影响外，其他处理对乳液粒径没有显著性影响。此外，W／O乳液粒径分布和平均粒径在试验期间没有明显的变化（数据未显示）。视觉观察试验也表明，乳液在存储过程中，所有处理没有相分离现象（数据未显示）。这说明在该试验条件下，乳液液滴尚未发生聚结、沉积而失稳。

图1分为不同表面活性剂用量下W／O乳液水滴平均粒径及其分布。由图1可以明显看出，W／O乳液表面活性剂用量增加导致乳液水滴粒径显著降低；另外，乳液制备时，表面活性剂用量不同，水滴粒径分布产生明显的差异：表面活性剂（乳化剂）用量较低时（如0.3%、0.5%PGPR），W／O 乳液水滴粒径为双峰分布，而表面活性剂含量较高时，乳液粒径为单峰分布（例如1.0%PGPR）。在试验研究期间，平均粒径和粒径分布没有明显变化（如图1）。含有1.0%PGPR乳液，在室温下储存6个月后，没有相分离现象发生，而0.3%、0.5%PGPR乳液在相同的储存期出现相分离。Márquez等［12］发现类似现象：PGPR浓度增大能减小W／O乳液水滴粒径，并提高W／O乳液的物理稳定性。该学者认为，液滴粒径减小能降低微滴之间的碰撞几率，进而降低微滴之间的聚结作用。此外，提高PGPR用量能增大乳液的粘度，这也可能导致液滴聚结几率的降低［13］。

图1 PGPR用量对W／O乳液粒径分布影响

2.2 水油界面及对W／O乳液脂质氧化稳定性影响

W／O乳液是油脂存在于食品的重要形式，如同O／W乳液，水的引入使W／O乳液同样具有油水界面，为研究该水油界面存在对脂质氧化稳定性影响，将占核桃油质量分数2%的水加入其中，检测含核桃油乳液体系中产生的初级氧化产物-脂质氢过氧化物和次级产物-顶隙己醛含量，结果如图2所示。

图2表明，水加入核桃油制备的W／O乳液，体系脂质氢过氧化物和己醛生成率都高于纯油体系，如，在核桃油纯油体系中，脂质氢过氧化物和己醛形成延迟期分别为16、15 d而水的加入将两种产物的延迟期都缩短到10 d，表明水的引入加速了脂质氧化。该研究结果有别于Fritsch［14］对W／O体系油脂氧化的阐述，Fritsch认为，由于W／O脂质相表面直接暴露于空气中，乳液脂质氧化速率类似于纯油体系。如前所述，在过渡金属离子作用下脂质氢过氧化物分解成高活性的自由基是促进O／W体系脂质氧化的主要原因。W／O体系与O／W体系相似，水分的引入同样使W／O乳液形成油水界面，具有表面活性的脂质氢过氧化物有可能积累于乳液液滴水油界面上，与水相促氧化剂如内源过渡金属离子相互作用，加速油脂氧化。

图2 水油界面对W／O乳状液脂质氧化稳定性的影响

2.3 表面活性剂用量对W／O乳液脂质氧化稳定性影响

O／W乳液表面活性剂的用量对脂质氧化稳定性有很大程度的影响［7］。试验研究表明，PGPR具有良好的亲水亲油性，能形成稳定的W／O乳液，因此，本课题以PGPR为表面活性剂，为确定W／O体系中表面活性剂用量是否影响脂质氧化稳定性，将不同用量PGPR（分别为乳液质量分数0.3%、0.5%、1.0%）添加于W／O体系，测定体系脂质氢过氧化物和己醛的形成，结果如图3所示。试验研究发现，随着W／O中表面活性剂用量的增加，乳液水滴粒径趋于降低，因此油水界面的表面积趋于增大。据Lee等［15］研究，油水界面增大会导致脂质氧化速率降低。但是，图3结果显示相反的趋势：随着乳液粒径的降低（即油水界面表面积的增大），脂质氧化稳定性反而提升，这表明在W／O乳液中较高的表面活性剂含量更有利于提高乳液的氧化稳定性。

图3 PGPR用量对W／O乳状液脂质氧化稳定性的影响

在O／W体系中，小分子表面活性剂能吸附于乳液液滴表面，直至饱和，油水界面表面活性剂到达饱和后，剩余的表面活性剂将溶于连续相［5］。如果连续相内表面活性剂的浓度超过CMC，表面活性剂以胶束形式存在。这些表面活性剂胶束能结合亲脂性或两亲性化合物，从而改变这些分子在乳液油相、水相、油水界面的区位分布，导致乳液脂质氧化稳定性改变。Nuchi等［9］研究发现，表面活性剂胶束体系对具有表面活性的脂质氢过氧化物有增溶作用，使其远离液滴界面，从而提高乳液脂质氧化稳定性。与O／W体系相反，过量的表面活性剂在W／O体系中形成反胶束。图3显示的PGPR较高浓度对W／O乳液的脂质氧化的抑制作用有可能是由于脂质氢过氧化物与过量的PGPR相互作用，形成混合反胶束，使其溶解于连续相，从而降低了脂质氢过氧化物在油水界面浓度。可见，PGPR浓度对W／O乳液氧化稳定性影响有可能与脂质氢过氧化物在乳液不同相之间的分布有关。为证实该假设，本课题采用MCT替代核桃油，制备W／O模拟体系，与体系添加脂质氢过氧化物，测定不同PGPR浓度对脂质氢过氧化物油相分布的影响，结果如图4所示。

由图4看出，W／O体系PRGR用量对脂质氢过氧化物在连续相分布具有显著性影响。随着PGPR增加，脂质氢过氧化物在连续油相的含量增大。可见，过量PGPR有可能形成反胶束，与两亲性脂质氢过氧化物相互作用，将其从油水界面转移至反胶束内部，因而进入连续相，导致脂质氢过氧化物在连续油相浓度增加。据此推断，脂质氢过氧化物在连续油相中浓度的增大可能与PGPR反胶束形成有关。但试验研究发现，随PGPR浓度增大，核桃油-水界面张力降低，PGPR浓度增大到2%，油水界面张力仍然有降低趋势，表明在该体系中，PGPR无固定CMC。然而，当前试验结果表明，采用0.3%PGPR可以获得稳定的W／O乳液。因此，过剩的PGPR可能溶于脂质连续相，与脂质氢过氧化物相互作用，形成混合反胶束，从而降低脂质氢过氧化物在油水界面浓度。

图4 在W／O模拟体系中PGPR用量对乳液连续相脂质氢过氧化物分布的影响

2.4 表面活性剂用量对W／O乳液氧化稳定性影响机理

为进一步探究表面活性剂浓度对W／O乳液脂质氧化影响机理，该研究采用MCT取代核桃油，于油相添加脂质氢过氧化物，于水相添加过渡金属离子Fe2+，制备W／O模拟体系，测定脂质氢过氧化物的降解速率，结果如图5所示。

图5 W／O模拟体系中PGPR用量对Fe2+诱导的脂质氢过氧化物的分解的影响

图5 清晰显示：未添加Fe2+的样品（对照组），在6 h测定期间，脂质氢过氧化物相对稳定，而添加Fe2+的乳液，脂质氢过氧化物浓度都明显降低，说明水相Fe2+存在加速脂质氢过氧化物的分解。该研究结果进一步说明脂质氢过氧化物具有表面活性，能积累于W／O体系的油水界面，与过渡金属离子接触，加速其分解形成自由基。图5同时表明，表面活性剂用量增加导致脂质氢过氧化物分解速率降低，该结果再次证实：脂质氢过氧化物可以与过量的PGPR相互作用，导致其从油水界面移除，阻碍脂质氢过氧化物与水相过渡金属离子接触，从而降低W／O乳液脂质氧化速率。

3 结论

在W／O体系，油水界面存在加速乳液脂质氧化。PGPR用量增大显著降低乳液水滴粒径，提高乳液物理稳定性；同时，PGPR含量增加明显提升乳液脂质氧化稳定性。过量PGPR与脂质氢过氧化物相互作用，增加了脂质氢过氧化物在油相的浓度，并降低了脂质氢过氧化物分解速率。

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Analysis of Factors Influencing the Physical and Oxidative Stability of Water-in-Walnut Oil Emulsions

Yi Jianhua1Sun Yifei1Zhu Zhenbao1Dong Wenbin1Huang Xin2
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology1，Xi′an 710021）
（Jiaozuo Testing Center for Grain and Oil Quality Safety2，Jiaozuo 454003）

Walnut oil was applied to prepare the water-in-oil（W／O）emulsions were prepared by applying walnut oil as oil phase，employing polyglycerol polyricinoleate （PGPR）as the surfactant.Emulsions were stored at 55℃ in the dark，and the mean particle size and particle size distributions and the like of drops of emulsions were measured every other day.Meanwhile，the formation of primary oxidation products （lipid hydroperoxides）and secondary oxidation products（headpace hexanal）were examined to evaluate influence of water-oil interface and surfactant dose on the stability of W／O emulsions.The results show that the presence of water-oil interface accelerates the oxidation of emulsion lipids，and reduces the oxidative stability of W／O emulsions.With PGPR at the levels of 0.3%～1.0%，increasing of surfactant content significantly reduces the particle size of drops of emulsions and improves the physical stability of the emulsions.In addition，increasing of surfactant content dramatically prolongs the delay phase between the primary products and secondary products，and improves the oxidative stability of emulsion lipids，The interaction of excess surfactant and lipid hydroperoxides increases the concentration of lipid hydroperoxides in the lipid phase，and results in the reduction of the decomposition rate of such primary oxides.

water-oil interface，water-in-oil（W／O）emulsions，lipid oxidation，surfactant

TS201.2

A

1003-0174（2016）11-0049-06

陕西省科技厅农业攻关（2014K01-10-04）

2015-03-23

易建华，女，1971年出生，博士，油脂与植物蛋白工程

董文宾，男，1951年出生，教授，油脂与植物蛋白工程