测定饮料中咖啡因含量的综合性实验

张文珠， 王添爽， 赵 洋， 冯晴晴， 潘玉珍， 刘潇彧

(大连理工大学 化工与环境生命学部 基础化学实验中心，辽宁 大连 116024)



测定饮料中咖啡因含量的综合性实验

张文珠， 王添爽， 赵 洋， 冯晴晴， 潘玉珍， 刘潇彧

(大连理工大学 化工与环境生命学部 基础化学实验中心，辽宁 大连 116024)

结合有机化学实验内容,采用蒸馏法用乙醇溶剂从茶叶中提取咖啡因晶体，用高效液相色谱仪考察了流动相组成对样品分离效果的影响，发现增大甲醇浓度，咖啡因的保留时间随之减少。咖啡因浓度20～100 μg/mL，线性方程为A=2.38C+33.4，R2=0.991。最后，通过高效液相色谱法(HPLC)测定市售绿茶饮料、可乐和功能饮料中的咖啡因含量，所得色谱图中无干扰叠加峰，并且在几种饮料中均含有一定量的咖啡因，建议需适量摄取含咖啡因的饮料。

咖啡因； 高效液相色谱法； 提取

0 引 言

咖啡因多存在于茶叶、咖啡豆、可可等植物组织中，是一种黄嘌呤生物碱化合物[1]，作为中枢神经兴奋剂，适度食用具有驱走睡意、消除疲劳、兴奋神经等作用[2]，因此有咖啡因成分的咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销。但是,大剂量或长期使用,有抗药性及成瘾性，会损害人体健康，被列入受国家管制的精神药品范围，因此对食品中咖啡因含量的检测非常必要[3-4]。本实验从溶剂提取入手，首先提取了茶叶中的咖啡因作为标准品。然后利用高效液相色谱法(HPLC)，测定了一定量市售绿茶、可乐和功能饮料实际样品中咖啡因的含量[5-7]。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。Hypersil ODS2 (200 mm×4.6 mm，5 μm)(中国科学院大连化学物理研究所)。20 μL微量进样器。

甲醇为色谱纯(Sigma公司)。咖啡因标准品由茶叶提取后，升华提纯，经熔点仪结合色谱仪检验为色谱纯。水为超纯水。其他试剂均为分析纯。绿茶饮料、可乐和功能饮料样品均购自当地超市。

1.2 实验条件

流动相为甲醇∶水=30∶70(体积比)；流速0.5 mL/min；进样量10 μL；紫外检测波长275 nm；柱温为室温。

1.3 茶叶中咖啡因的提取

方法一：称取10 g研细的茶叶，10 g碳酸钙转入盛有150 mL蒸馏水的烧杯中，用小火加热煮沸30 min(期间加入少量的蒸馏水以弥补蒸发了的水分)。趁热过滤，将滤液倒入干净的烧杯中，浓缩至10 mL左右，转入蒸发皿并加入2 g氧化钙，用小火焙干后研细备用(焙干时温度不宜过高，避免升华)。取一支合适的短颈漏斗，颈部用脱脂棉塞住，罩在隔以刺有许多小孔的滤纸的蒸发皿上，小心加热进行升华(适当控制火焰，尽可能使升华速度放慢，提高结晶纯度)，升华结束后冷却至室温，再揭开漏斗和滤纸，收集产品[8]。

方法二：称取10 g研细的茶叶末和75 mL 95%乙醇，放入圆底烧瓶中，水浴加热，连续提取2～3 h，停止加热[9-11]。冷却至室温后，改成蒸馏装置，回收提取液中的大部分乙醇，趁热将瓶中的残液倾入蒸发皿中，拌入3～4 g生石灰粉，使成糊状，在蒸气浴上蒸干，期间应不断搅拌，并压碎块状物。将蒸发皿放在石棉网上，用小火焙炒片刻，使水分全部除去。冷却后，擦去粘在边上的粉末，以免在升华时污染产物。取一只口径合适的玻璃漏斗，罩在隔以刺有很多小孔滤纸的蒸发皿上，用沙浴小心加热升华。控制沙浴温度在220 ℃左右[12]。当滤纸上出现许多白色针状结晶时，暂停加热，让其自然冷却至100 ℃左右。小心取下漏斗，揭开滤纸，用刮刀将纸上和器皿周围的咖啡因刮下，称重。

1.4 饮料中咖啡因的测定

1.4.1 标准曲线的绘制

咖啡因母液的配置：准确称取咖啡因纯品0.010 g于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀冷藏待用。

咖啡因标准溶液的配置：分别用移液枪移取200、400、600、800和1 000 μL咖啡因母液于5个10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻线，摇匀[13]。进样前用0.25 μm滤膜过滤。

标准曲线的测定：分别用微量进样器抽取10 μL上述标准样品进样分析，并绘制标准曲线。

1.4.2 样品前处理及测定

取25 mL的绿茶饮料于50 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀。取25 mL的可乐于50 mL容量瓶中先超声脱气15 min，以去除可乐中的CO2，加入超纯水稀释至刻度，摇匀[14]。取3 mL的功能饮料于50 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀。进样前用0.25 μm滤膜过滤上述样品溶液分别置于离心管中，依次抽取10 μL进样分析。

2 结果与讨论

2.1 茶叶中提取咖啡因的结果分析

实验中所用的方法一为茶叶加入碳酸钙后，加水煮沸提取，经多次实验后几乎没有产物产生。而方法二有大量针状晶体生成。对实验过程进行分析，发现方法一的缺点在于咖啡因在水中的溶解度小于在热的乙醇中的溶解度，因此用水作为提取溶剂不利于咖啡因的提取。另外，加入氧化钙焙干时也难以控制反应温度和时间。方法二中沙浴升华时，升华时间过长或温度过热会导致粉末碳化，影响产率。所以，提取实验的关键步骤是控制好实验条件，如提取溶剂、反应时间和反应温度等。

2.2 流动相中甲醇比例对咖啡因分离的影响

在液相色谱建立标准曲线实验之前,为了保证实际样品中咖啡因色谱峰与杂质成分色谱峰之间互不干扰，首先考察了流动相中甲醇比例对咖啡因分离的影响。分别将流动相中甲醇浓度调节为20%、30%和40%。如图1所示，当甲醇浓度从20%升高到40%，咖啡因的保留时间也随之减少。考虑到实际样品中其他组分对咖啡因出峰的影响和分析时间的节省，最终选用了甲醇∶水=30∶70为本次实验的流动相。从图2可以看出，即使是不同饮料的实际样品也不会有干扰叠加峰[15-16]。

图1 流动相中甲醇比例对咖啡因保留行为的影响

2.3 咖啡因标准曲线的绘制

分别取20、40、60、80和100 μg/mL的咖啡因标准溶液进样分析，以咖啡因浓度为横坐标，色谱峰面积为

图2 咖啡因标准溶液(a)和不同样品可乐(b)、绿茶(c)、功能饮料(d)的液相色谱图

纵坐标，得到实验所需标准曲线，如图3所示。从图中可以看出,线性拟合良好，线性方程为A=2.38C+33.4，线性范围20～100 μg/mL，R2=0.991。

图3 咖啡因浓度和峰面积线性关系图

2.4 实际样品中咖啡因含量的测定

以市场上随机购买的绿茶饮料、可乐和功能饮料作为实际样品，利用上述标准曲线法测定了不同饮料中咖啡因的含量，测定结果见表1。发现，不仅咖啡、茶叶中含有咖啡因，在可乐、绿茶和功能饮料中均含有一定量的咖啡因。尽管饮用含咖啡因的饮料可以帮助人们在短期内摆脱睡意，振奋精神，但长期大量饮用还是具有一定风险，对人体存在着诸多不利影响，譬如：咖啡因会影响人体对钙质的吸收，刺激中枢神经系统[17-19]等。因此建议每日需适量摄取含咖啡因的饮料；老人、儿童和孕妇最好减少对含咖啡因饮料的摄取。

表1 实际饮料样品中咖啡因的测定结果

3 结 语

本实验将有机实验和仪器分析实验结合在一起，实验中所用到的色谱纯咖啡因标样是以茶叶为原料由学生自己动手制备提纯所得，既提高了学生的实验技能,又很好地解决了实验中所需标准样品购买昂贵、手续复杂的问题。用液相色谱仪通过建立外标法，测定了一系列饮料中的咖啡因含量，液相色谱仪的使用能够有效地避免实际样品中其它组分的干扰，准确地进行定量分析。

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Comprehensive Experiment for Determination of Caffeine Content in Beverages

ZHANGWen-zhu,WANGTian-shuang,ZHAOYang,FENGQing-qing,PANYu-zhen,LIUXiao-yu

(Faculty of Chemical, Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology, Dalian 116024, China)

This experiment for determination of caffeine content was designed in the paper. Firstly, using solvent extract method, caffeine crystal was extracted from tea by ethanol as a solvent. Then the effect of mobile phase in sample separation has been investigated by HPLC. As increasing the concentration of methanol, the retention time of caffeine decreased accordingly. Next, the external standard method was established to detect the caffeine concentrations in high-performance liquid chromatography. The linear equationA=2.38C+33.4 held a good linear fitting in the range of 20—100 μg/mL. and the square of the correlation coefficient was 0.991. Finally, caffeine concentrations in several beverages such as green tea, coke and energy drinks bought from supermarket were detected by HPLC, No interference peaks were observed in the chromatograms. Caffeine was found in all of these beverages, so the public should reduce intake of caffeine containing drinks.

caffeine； high-performance liquid chromatography； extraction

2015-03-19

国家自然科学基金项目(No.21205009)；大连理工大学教学改革基金项目(HG201427)

张文珠(1973-)，女，湖北蕲春人，博士，副教授，研究方向：色谱和荧光、电化学发光探针的研究以及教学与管理。

Tel.:0411-84706291；E-mail:wzhzhang@dlut.edu.cn

O 657.7+2

A

1006-7167(2016)01-0013-03