高脂血症性急性胰腺炎大鼠胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达观察

吴娟，张强，邓明明

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)



·基础研究·

高脂血症性急性胰腺炎大鼠胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达观察

吴娟，张强，邓明明

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的 观察高脂血症性急性胰腺炎大鼠胰腺组织钠钙交换蛋白1(NCX1)、微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)、自噬相关基因Beclin-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)蛋白表达。方法 清洁级健康雄性SD大鼠40只随机分为A、B、C、D组各10只；A组制作高脂血症性急性胰腺炎模型，B组制作急性胰腺炎模型、C组制作高脂血症模型，D组仅禁食、禁饮后麻醉大鼠，1 mL/kg注射生理盐水。造模12 h时处死各组大鼠取胰腺组织，采用Western blotting法检测各组胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白。结果 A、B组NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的相对表达量均高于C、D组，P均<0.05。A组LC3 II、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的相对表达量均高于B组，P均<0.05。C、D两组NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9比较，P均>0.05。结论 高脂血症性急性胰腺炎大鼠胰腺组织中NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9均高表达。NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9可能在高脂血症性急性胰腺炎的发生发展中发挥作用。

高脂血症；急性胰腺炎；钙交换蛋白1；微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ；自噬相关基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；动物实验

急性胰腺炎是常见的急腹症之一，高脂血症性急性胰腺炎是指由严重的高甘油三酯血症所引起的一类胰腺炎，其发病率逐年升高[1]，但具体发病机制目前尚不明确。既往研究发现，高脂血症性急性胰腺炎可能与CRAC、TRPV1、TRPV3钙通道有关[2～4]。钠钙交换蛋白(NCX1)参与炎症相关性疾病的钙离子调控[5～8]。前期研究[9]证实急性胰腺炎患者胰腺组织中存在NCX1 mRNA及蛋白高表达。自噬是腺泡细胞内广泛存在的生理现象，急性胰腺炎可导致机体出现应激性自噬或者缺陷性自噬[10]。微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)、自噬相关基因Beclin-1是检测自噬体形成的特异性标记蛋白[11]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)是细胞凋亡过程中的关键执行分子，参与许多凋亡信号传导途径。目前尚未见脂质代谢异常、钙通道、自噬在高脂血症性急性胰腺炎发生发展中的作用机制相关报道。2015年9月～2016年5月，我们观察了高脂血症性急性胰腺炎大鼠胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 清洁级健康雄性SD大鼠40只，鼠龄2～3个月，体质量180～220 g，饲养于室温22～25 ℃的动物房内，40%～70%恒定湿度条件下自由摄食和饮水，自然昼夜节律适应性饲养1周。四丁酚醛(Tyloxapol，烷基芳基聚醚醇型的非离子液体聚合物)及3.5%牛黄胆酸钠购自美国Sigma公司，NCX1、Caspase-3抗体购自英国Abcam公司，LC3 Ⅱ、Beclin-1抗体购自美国CST公司,Caspase-9购自武汉三鹰公司。

1.2 大鼠分组及高脂血症性急性胰腺炎模型制备方法 40只大鼠按照随机数字表法分为A、B、C、D组各10只，A组制作高脂血症性急性胰腺炎模型，采用尾静脉注射Tyloxapol的方法[12]制作高脂血症动物模型： 将Tyloxapol稀释成10% Tyloxapol水溶液3 mL/kg尾静脉注射，12 h后成模。造模成功标准：12 h后尾静脉取血并分离血清，全自动生化分析仪检测血清甘油三酯、胆固醇，Tyloxapol注射组大鼠血清甘油三酯以及胆固醇达对照组3倍以上视为造模成功。最终造模成功20只。采用逆行胰胆管注射牛黄胆酸钠[13]制作急性胰腺炎模型： 12 h禁食、8 h禁饮，2%戊巴比妥钠3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰卧位固定后消毒备皮，沿腹正中线做5 cm纵行切口，自幽门处沿十二指肠降段寻找到十二指肠大乳头，用无损伤动脉夹夹闭胆总管的肝门端，用磨钝的1 mL注射器在胆总管十二指肠开口位置的对侧肠壁找一无血管区穿刺进入胰胆管，3.5%牛黄胆酸钠溶液1 mL/kg缓慢注入胰胆管，速度0.1 mL/min,待胰腺组织出现水肿出血后，松开动脉夹，拔出注射器，将肠管还纳至腹腔后，关闭腹腔。造模成功标准：造模后12 h，麻醉大鼠，下腔静脉取血并分离血清，全自动生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶，以正常大鼠血中淀粉酶作为对照组；完整切取胰腺组织，固定于中性甲醛溶液中，用于制作病理学切片，观察切片胰腺组织的炎症坏死情况，进行病理学评分，以正常大鼠的胰腺组织作为对照组；若造模组切片的病理学评分以及血清淀粉酶、脂肪酶与正常组相比有显著差异性则视为造模成功。最终造模成功15只。B组制作急性胰腺炎模型方法同上、C组制作高脂血症动物模型方法同上，D组为空白对照，仅禁食、禁饮后麻醉大鼠，1 mL/kg注射生理盐水。

1.3 各组胰腺组织NCX1、LC3Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白检测方法 采用Western blotting法。造模12 h时处死各组大鼠，取胰腺组织，蛋白裂解液量提取组织中蛋白，95 ℃水浴5 min，采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品总蛋白浓度,取6 μL/孔总蛋白，SDS-PAGE电泳90 min，常规转膜，5%脱脂牛奶室温封闭3 h,TBST洗膜，加入稀释的NCX1、LC3Ⅱ，Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入稀释的NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9二抗(1:10 000)室温孵育30 min, ECL曝光显影。以GAPDH作为内参，用Image J软件进行灰度扫描进行定量分析。以目的蛋白与GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料采用表示，组间比较首先行Levene检验，若方差齐则采用完全随机方差分析，若结果有统计学意义，则进一步采用LSD法进行两两比；如方差不齐，则采用非参数检验的秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量比较见表1。

表1 各组胰腺组织NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量比较

3 讨论

存在脂质代谢障碍的患者中有15%～20%可能发生高脂血症急性胰腺炎[1]，在这些患者血中存在大量的不饱和脂肪酸、乳糜微粒等物质，血液呈现高凝状态，胰腺微循环障碍，加重胰腺局部缺血坏死；国外研究报道引起急性胰腺炎向重症急性胰腺炎(SAP)转化的是胰腺周围脂肪坏死脂解作用及其产生的不饱和脂肪酸;使用针对胰周脂肪坏死和抑制不饱和脂肪酸生成的药物可用于改善SAP预后，尤其是在高脂血症基础上发生的急性胰腺炎[14]。高脂血症对于胰腺的损伤是多角度、多途径的，所以高脂血症急性胰腺炎临床症状重，且易向重症转化，本研究旨在探讨参与高脂血症急性胰腺炎这种特性的可能途径。

生理状态下NCX1是钙外排的主要途径，例如在生理性的胰岛素分泌、心肌及神经元传导时NCX1的作用是泵出胞浆内多余钙离子以维持生理功能的平衡[4]，但在大多数疾病过程中NCX1的功能却发生了逆转。NCX1作为重要的双向钙通道，参与了消化系统许多疾病的发生发展过程，如实验性结肠炎的发生与NCX1通道的基因表达被抑制有关[5]、NCX1基因敲除的小鼠呈现出胃底的高度松弛并且胃排空加快[6]、NCX1与钙调蛋白以及NHX1形成的复合体共同参与调节IL-6相关的肝细胞癌的细胞学行为[7]。前期曾有文献报道急性胰腺炎中确实存在NCX1通道的开放，而通过本实验的研究结果可以看出，高脂血症急性胰腺炎NCX1通道蛋白的表达也是明显上调，但是与普通胰腺炎组相比并没有明显差异，由此可见，NCX1确实参与了高脂血症胰腺炎，但可能不是惟一参与调节的钙通道，参与高脂血症急性胰腺炎调控的可能存在多种通道，NCX1通道在这些钙通道中是否起着关键作用，还需进一步研究证实。

自噬是细胞内重要的降解途径，自噬以腺泡细胞基质内自溶酶体和自噬体的形成为主要特征， LC3是将细胞内LC3 Ⅰ转化成LC3Ⅱ,并且整合到自噬体膜上，当自噬体融合成溶酶体时LC3Ⅱ将会被降解，当发生急性胰腺炎时可以检测到LC3Ⅱ的浓度显著增高[16]，因为此时自噬体的融合障碍，LC3Ⅱ降解减少。Beclin-1蛋白也是重要的自噬分子标志，参与自噬前体的形成。在本研究结果当中，可以观察到，A组LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表达量与B组的表达量具有显著差异，表明在高脂血症急性胰腺炎中自噬功能受损程度较普通胰腺炎有增加的趋势。由此我们可以做出这样假设，高脂血症可以通过某种特殊途径或者某种物质影响自噬体的融合，影响胰腺局部以及全身代谢废物的清除，从而加速胰腺局部炎症坏死，加重胰腺炎症状。

急性胰腺炎中存在广泛的细胞凋亡、坏死[19]，自噬可以通过影响细胞内钙稳态以及酶原激活而引起腺泡细胞凋亡坏死，本研究发现，与空白对照组相比，急性胰腺炎中确实检测到钙通道蛋白、自噬相关蛋白、凋亡蛋白表达量、胰腺组织病理学评分、以及血清酶学的增高。更重要的是，在我们的实验结果中还观察到，高脂血症急性胰腺炎中上述各种指标(除钙通道蛋白外)与普通急性胰腺炎相比，均表现为明显的增高趋势。由此可见，在高脂血症这个特殊背景下，自噬以及钙超载相关通道得到了促进，致使高脂血症急性胰腺炎的凋亡坏死较非高脂状态下的急性胰腺炎更严重。

综上所述，高脂血症性急性胰腺炎组织中存在NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9高表达。NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9可能在高脂血症性急性胰腺炎的发生发展中发挥作用。

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泸州市-西南医科大学联合项目[2015LZCYD-S04(6/15)]。

邓明明(E-mail： 793070544@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.008

R657.5

A

1002-266X(2016)39-0027-03

2016-05-05)