同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨*

陈东辉，丘余良

（福建中医药大学附属人民医院肾病科，福建 福州 350004）

临床论著

同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨*

陈东辉，丘余良

（福建中医药大学附属人民医院肾病科，福建 福州 350004）

目的旨在通过同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术分析原发性肾病综合征（PNS）患者尿液差异表达蛋白,寻找高特异性、无创性评估PNS的病理损害标记蛋白，并结合相应蛋白功能探讨其在PNS发病机制及疾病进展中的作用。方法9例PNS患者肾穿刺当日和3例健康人的晨尿标本经毛细管高效液相色谱仪分离后，Q-Exactive质谱仪进行质谱分析，Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件进行查库鉴定、定量和数据分析。结果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱，并得到724个蛋白质组，其中≥2的唯一肽段308个，定量、查库鉴定和数据分析最终得到差异蛋白表达明显的19个。其中与3例健康对照患者差异表达的蛋白3个，包括抗胰蛋白酶（AAT）、抗胰凝乳蛋白酶（AACT）和微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7。结论iTRAQ技术评估PNS尿液蛋白质组变化具有现实可行性，可以用于更深入的研究。

原发性肾病综合征；同位素标记相对和绝对定量技术；尿液蛋白质组学

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是肾内科常见的临床综合征，占原发性肾小球疾病18%～21%。目前，评估PNS的病理损害程度主要依靠肾穿刺病理组织活检，但它仅仅是反映肾脏当时的病理损害程度，其有创性使得重复性检查受到很大的限制，也无法动态观测肾组织病理损害。近10余年来，随着尿液蛋白质组学技术的进一步发展，其逐渐成为临床上找寻疾病相关标志物的有效方法[1-2]。本研究旨在通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术分析9例PNS患者肾穿当日和3例健康人的晨尿标本寻找尿液中差异表达蛋白，同时结合相应蛋白功能探讨其可能在PNS发病机制及疾病进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象全部尿液标本来自福建中医药大学附属人民医院肾内科住院患者。其中9例均行肾脏穿刺病理组织活检确诊为PNS（肾小管间质纤维化轻型者3例、中型3例、重型3例）。健康人及肾小管间质纤维化轻型、中型、重型尿4组样本分别命名为A、B、C、D，体积（ml）均为100×3。

1.1.2 实验仪器和试剂质谱仪1、2（Thermo，USA），色谱1（Thermo Scientific EASY Column，USA），色谱2（GE Healthcare AKTA，USA），超声波系统（Biosafer 150-96，赛飞中国有限公司），真空离心浓缩仪（Eppendorf Concentrater Plus，德国），离心机（Eppendorf Centrisfuge 5424R，中国），恒温混匀仪（Eppendorf Thermomixer C，中国），紫外/可见光分光光度计（Eppendorf Bio Spectrometer，德国），小胶电泳系统（Biorad Mini-PROTEAN Tetr，USA），SDS、Tris、DTT、IAA和Urea（BioRad，USA），0.22μm超滤管（Corning Spin-X，USA），10kDa超滤管（Sartorius VIVACON 500，USA），iTRAQ标记试剂-8 PCex（ABsciex，USA）。

1.2 方法

1.2.1 采集样本采集肾穿刺前当日患者的清晨中段尿样本100 ml置于100 ml试管中，放置于-80℃冰箱冷冻保存，立刻送检。另外，取3例健康人清晨中段尿按上述方法送检。所有样本都在无菌操作下完成，均为非污染样本。

1.2.2 样本制备及蛋白质谱鉴定①样本制备。从-80℃冰箱中拿出24份样本，室温下冻融后，取每组样本的3个生物学重复样本各5 ml，将其合并成1个15 ml的总样本。待全部样本合并完成后，剩余样本保存。合并好的4组样本在4℃离心机中离心10 min（1 200 r/min），吸取上清液置于新50 ml预冷离心管中，迅速加入20 ml（-20℃预冷）10%TCA/丙酮，混匀后在-20℃冰箱中放置2 h，4℃离心30 min（10300r/min），弃上清液。在样本沉淀中加入20 ml（-20℃预冷）丙酮，混匀后在-20℃冰箱中放置1 h，4℃再次离心30 min（10 300 r/min），弃上清液，再重复该步骤1次。取最终4组样本冻干。向各组样本中加入1 ml SDT（4%SDS，pH 8.0 100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100 mmol/L DTT）裂解液，充分混匀，100℃加热5min，冰浴超声处理后再加热5min，20℃、11000r/min离心40min，将上清液过0.22μmol/L滤膜，取滤膜下清液为样本蛋白质裂解液。BCA法对蛋白质定量，样本先分装20μg各1份，剩下的分装成300μg，均置于-80℃冰箱冷冻保存。②酶解。取出所有样品的300μg组分。每份加入200μl UA缓冲液（8 mol/L Urea，150 mmol/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.5）混匀，14 000 g常温离心30 min，弃滤液，重复操作3次。加入100μl吲哚乙酸（50 mmol吲哚乙酸加入UA缓冲液），600 r/min振荡混匀1 min，室温避光300 r/min孵育30 min，再离心30 min。加入UA缓冲液100μl，室温离心30 min，重复3次。加入100μl 1/10溶解缓冲液，室温离心30 min，重复3次。弃滤出液并加入40μl胰蛋白酶缓冲液（2μg胰蛋白酶加入40μl 1/10溶解缓冲液），置于恒温混匀仪上（300 r/min，18 h，37℃）。室温离心30 min换管收集滤出液，加入25 mmol/L 1/10溶解缓冲液40μl，室温离心30 min，取滤液，采用OD280肽段定量。③肽段标记。从各组样品中分别取约100μg，按AB公司iTRAQ Reagent-8plex多重试剂盒（AB SCIEX）相关说明书进行标记，标记方法见表1。

1.2.3 SCX分级将所有标记后肽段分别混合，进行SCX预分级。层析柱：聚砜膜4.6×100 mm层析柱（5μmol/L，200/A）。缓冲液：缓冲液A为10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25%CAN；缓冲液B为10 mmol/L 25%CAN pH 3.0，500 mmol/L KCl，25%CAN。SCX分级见表2。每次SCX分级完成后，收集穿流及洗脱片段约30份，按照SCX色谱图合并成6份，冻干后C18柱样（Sigma）脱盐。

表1 AB公司iTRAQ Reagent-8plex肽段标记

表2 SCX分级

1.2.4质谱①毛细管高效液相色谱仪（HPLC）。每份分级后的样品采用纳升流速HPLC液相系统进行分离。色谱柱以95%的A缓冲液（0.1%甲酸水溶液）平衡。样品上样到上样柱（2 cm×100μmol/L 5μmol/L-C18），再经分析柱（75μmol/L×100 mm 3μmol/L-C18）分离（流速为250 nl/min）。相关液相梯度为0～105 min，B缓冲液（0.1%甲酸乙腈水溶液）线性梯度从0%～50%；105～110 min，B液线性梯度从50%～100%；110～120 min，B液维持在100%。②质谱鉴定。每份分级后的样品经HPLC分离后进行质谱分析。分析时长：120 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1 800 m/z，一级质谱分辨率：70 000atm/z 200，AGC目标：3 e6，一级最大IT值：10 ms，扫描范围数：1，动态排异：40.0 s。多肽和多肽碎片的质量电荷比采用每次全扫描后采集10个碎片图谱（MS2 scan），MS2激活类型：HCD，电荷窗：2 m/z，二级质谱分辨率：17 500 at m/z 200，Microscans：1，二级最大IT值：60 ms，标准化碰撞能量：30 eV，缺损率：0.1%。

1.3 数据分析

1.3.1 原始质谱数据用Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件对质谱分析原始数据进行查库鉴定、定量和数据分析。

1.3.2 数据库使用NCBI_Human_879034_201412 25数据库（蛋白质序列共141 033条）。

1.3.3 Maxquant搜索Maxquant软件版本为1.4.1.2。相关参数见表3。

表3 Maxquant软件相关参数

1.3.4 定量分析软件提取肽段报告离子峰强度值的信息，肽段定量为参考样品所在标签的信号强度值。蛋白质定量为鉴定肽段定量结果的中位数。1.4统计学方法

实验总共分4组，分别对A、B、C、D 4组资料进行t检验和倍数分析，并对其做两两比较，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，倍数取1.5倍或1.2倍，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电泳图谱

采用SDS-PAGE电泳技术成功获得较为满意的电泳图谱，根据Marker值，样品中最粗的条带50～75 kD。见图1。

图1 SDS-PAGE电泳图谱

2.2 SCX分级

成功获得SCX分级，其中UV214吸收值最明显的管号为6、7，约550 mAU，见图2。

图2 SCX分级

2.3蛋白质定量统计结果

SCX分级脱盐后的6个fraction经质谱分析及查库，结果合并后按照Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01筛选过滤。最终鉴定肽段2631个，唯一肽段2021个，蛋白质组724个，蛋白质组（唯一肽段≥2） 308个。

2.4 蛋白质显著性分析结果

实验共分4组，鉴定出19个相关差异蛋白。其中标记的抗胰蛋白酶（alpha1-antitrypsin，AAT）、微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7（Tubulin tyrosine ligase like 7，TTLL7）中健康人（N）与原发性肾病综合征肾小管间质纤维化轻型（L）、中型（M）、重型（H）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 健康人与原发性肾病综合征肾小管间质不同程度纤维化蛋白质表达情况比较

3 讨论

基于以上相关研究结果，笔者成功得到比较清晰的PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱，并得到PNS相关差异表达蛋白。其中与3例健康人差异表达的蛋白AAT、抗胰凝乳蛋白酶（Antichymotrypsin，ACT）、TTLL7已经有相关的研究，其导致肾脏损害的机制可能与肾小管间质病变、氧化应激和免疫炎症等有关。

AAT是一种急性时相炎症反应蛋白，研究表明该蛋白是血浆中最主要的蛋白酶抑制剂，主要由肝细胞分泌；此外，肾、脾等也能产生AAT。研究表明，AAT能够抑制血清中的各种酶，此外还有抗炎、调节细胞增殖及凋亡、调节免疫等功能。国内外相关研究表明，在肾小管损伤后，肾小管上皮细胞反应性地表达AAT[3-5]。HIDVEGI等[6]研究表明，AAT能够活化核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB），NF-κB在肾脏纤维化的形成过程中有重要作用，当炎症因子及肾脏损伤导致体内外肾小管上皮细胞的NF-κB因子活化，调节多种促炎因子的转录表达，最终促使肾组织细胞外基质（ECM）沉积和降解失衡，从而导致肾脏纤维化的发生。本研究中健康人尿液中未见AAT的表达，且与其他几组比较差异有统计学意义，据此推测尿液中检测出AAT提示存在肾小管上皮细胞损伤。

ACT是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，也是一种急性期反应蛋白，研究表明具有促进淀粉样蛋白聚合成蛋白丝，同时帮助蛋白丝抵抗水解消化，还具有调节炎症过程以及可作为非特异性肿瘤标志物[7]。目前研究还发现，ACT在免疫调控方面有一定作用，它能抑制体内细胞毒性T淋巴细胞活性、抑制血管紧张素转化酶，阻止血管紧张素Ⅰ转化成血管紧张素Ⅱ。且有文献报道其功能状态与NF-κB存在关联[8]。有学者提出IgA肾病发病机制可能与患者上呼吸道感染后，肾小球基底膜出现原位或者循环免疫复合物沉积，致使机体启动免疫应答，导致肾小球免疫损伤，ACT大量合成和释放有关[9]。此外，一项有关早期IgA肾病和薄基底膜肾病的尿液蛋白质谱分析也有ACT表达[10]。因此，笔者推断ACT在肾脏损害过程中有重要作用，但其在PNS的作用机制还有待进一步研究。

本研究的TTLL7结果表明，硝基化酪氨酸可以通过微管蛋白酪氨酸连接酶整合成为微管蛋白，形成硝基化酪氨酸微管蛋白，能显著地改变微管的结构，导致细胞的变形、黏附能力的下降和胞内运输障碍，最终导致细胞凋亡和器官功能丧失[11]。而TTLL可以抑制硝基化酪氨酸微管蛋白的生成过程。目前，罕见有关TTLL7在肾脏病发病机制的相关研究，其在PNS发病机制及疾病进展中所起的作用尚需进一步深入研究。

iTRAQ技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到较为广泛的应用，具有高度准确性和敏感性。但iTRAQ试剂几乎与样本中的所有蛋白结合，容易受样本中的杂质蛋白和样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染。因此，本研究的实验样本在无菌条件下进行，同时，在样品处理过程中使用Aurum Serum Protein Mini Kit去除白蛋白，一定程度上提高SDS-PAGE图像分辨率，但是基于PNS白蛋白在尿液中相对含量高，且个体差异大，可能超过蛋白吸附柱的最大负荷，导致尿样中少量白蛋白的残余，可能导致无法呈现出所有的差异蛋白。

笔者通过iTRAQ等相关技术成功获得PNS的尿液蛋白质谱，同时标记出相关差异表达蛋白，基于原发性肾病综合征与正常人的尿液蛋白质谱的对照而言，对以上3种差异表达蛋白的研究有望成为评估PNS的新的蛋白标志物。然而，该蛋白在疾病进展中的敏感性和特异性还需要在更大样本量、更多其他肾脏疾病患者中验证，这将会是笔者下一步研究的重点。

[1]RAIMONDO F,CERRA D,MAGNI F,et al.Urinary proteomics for the study of genetic kidney diseases[J].Expert Rev Proteomics,2016,13(3):309-324.

[2]SURESH C P,SAHA A,KAUR M,et al.Differentially expressed urinary biomarkers in children with idiopathic Nephrotic syndrome[J]. Clin Exp Nephrol,2016,20(2):273-283.

[3]GRATEROL F,NAVARRO-MUÑOZ M,IBERNON M,et al. Poor histological lesions in IgA nephropathy may be reflected in blood and urine peptide profiling[J].BMC nephrology,2013,14(1):1.

[4]ZAGER R A,JOHNSON A C M,FROSTAD K B.Rapid renal alpha-1 antitrypsin gene induction in experimental and clinical acute kidney injury[J].PloS One,2014,9(5):e98380.

[5]VAN’T WOUT E F A,VAN SCHADEWIJK A,LOMAS D A,et al.Function of monocytes and monocyte-derived macrophages in α1-antitrypsin deficiency[J].European Respiratory Journal,2015, 45(2):365-376.

[6]HIDVEGI T,SCHMIDT B Z,HALE P,et al.Accumulation of mutant α1-antitrypsin Z in the endoplasmic reticulum activates caspases-4 and-12,NFκB,and BAP31 but not the unfolded protein response[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(47): 39002-39015.

[7]JIN Y,JIE W,YE X,et al.Identification of GlcNA cylated alpha-1-antichymotrypsin as an early biomarker in human nonsmall-cell lung cancer by quantitative proteomic analysis with two lectins[J].British Journal of Cancer,2016,25(1):160-167.

[8]BAKER C,BELBIN O,KALSHEKER N,et al.SERPINA3(aka alpha-1-antichymotrypsin)[J].Front Biosci,2007,12:2821-2835.

[9]肖姣.尿液蛋白质组学在IgA肾病激素治疗前后的比较[D].大连:大连医科大学,2012.

[10]MOON P G,LEE J E,YOU S,et al.Proteomic analysis of urinary exosomes from patients of early IgA nephropathy and thin basement membrane nephropathy[J].Proteomics,2011,11(12): 2459-2475.

[11]DAS V,KANAKKANTHARA A,CHAN A,et al.Potential role of tubulin tyrosine ligase-like enzymes in tumorigenesis and cancer cell resistance[J].Cancer Letters,2014,350(1/2):1-4.

（申海菊 编辑）

Preliminary study on change of urine protein spectrum in nephrotic syndrome patients by isotope labeling quantitative technique*

Dong-hui Chen,Yu-liang Qiu
(Department of Nephrology,the People's Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian,350004,China)

Objective To use isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)analysis of different urinary protein expression in patients with primary nephrotic syndrome(PNS),look for noninvasive and highly-specific marker proteins that are able to evaluate the pathological damages in those patients,and to explore their possible roles in the pathogenesis and disease progression of PNS.Methods Nine patients with PNS and 3 healthy adults were selected in this study.Morning urine samples of the 3 healthy adults and urine samples of the 9 PNS patients obtained on the day of renal biopsy were analyzed with iTRAQ technique and capillary high performance liquid phase chromatography with Q-Exactive mass spectrometer(thermo Finnigan),then the data were identified,quantified and analyzed using the software Maxquant 1.4.1.2 and persus 1.4.1.3.Results The urine protein SDS-PAGE electrophoresis map of the PNS patients was successfully obtained.Among the 724 proteins(groups)obtained,308 were the unique peptides≥2.The obtained data were identified,quantified and analyzed by the software Maxquant 1.4.1.2 and persus 1.4.1.3.As a result,19 differentially-expressed proteins were obtained.Among which there were 3 proteins differently expressed from those of the 3 healthy controls,which were alpha 1-antitrypsin,antichymotrypsin and tubulin tyrosine ligase analogues 7.Conclusions iTRAQ technique is feasible for evaluation of urine proteome in patients with pri－mary nephrotic syndrome(PNS).Using this method,the variety of differential expression of urine protein can be found,thus the data could be used for further research.

primary nephrotic syndrome;isobaric tags for relative and absolute quantitation;urine proteomics

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.013

1005-8982（2016）23-0063-05

2016-05-23

国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（No：JDZX2012017）；福建省中医药科研项目（No：wzsb201305）

丘余良，E-mail：748778837@qq.com；Tel：0591-86255607