Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义

陶德友 吴丽平 胡金喜

●论 著

Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义

陶德友 吴丽平 胡金喜

目的 研究叉头/翼状螺旋转录因子（Foxp3）、神经纤毛蛋白（NRP）在乳腺浸润性导管癌（IDC）中的表达及其临床意义，并探讨Foxp3、NRP1和NRP2表达的相关性。方法 采用免疫组化En Vision法检测108例乳腺IDC、45例纤维腺瘤和66例正常乳腺组织中Foxp3、NRP1和NRP2的表达，分析3者的表达与乳腺癌临床病理因素及基因分型的关系。结果 在正常乳腺组织、纤维腺瘤和乳腺IDC中Foxp3、NRP1和NRP2阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。乳腺IDC中Foxp3表达与组织学分级、淋巴结转移和TNM分期有关（均P＜0.05）；NRP1和NRP2表达均与淋巴结转移和TNM分期有关（均P＜0.05）。Foxp3、NRP1和NRP2表达两两均呈正相关（均P＜0.05）。结论 乳腺IDC中Foxp3、NRP1和NRP2呈现高表达，联合检测Foxp3、NRP1和NRP2对于评估乳腺癌的生物学特性、预后和指导治疗具有重要的临床价值。

叉头/翼状螺旋转录因子 神经纤毛蛋白1 神经纤毛蛋白2 乳腺癌 基因分型

叉头/翼状螺旋转录因子（forkhead/winged-helix，Foxp3）是叉头样转录因子家族成员之一，在调节CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）发育过程中起重要作用。体外实验证实，Foxp3在肺癌、结肠癌、乳腺癌、急性T细胞白血病等不同组织起源的多种肿瘤细胞系存在不同水平的表达[1]。神经纤毛蛋白（neuropilin,NRP）最初被鉴定为神经元受体，作为肿瘤相关生长因子的共受体。NRP家族由NRP1和NRP2两种基因构成。近来研究显示，NRP参与多种信号传导通路，导致细胞骨架组织、血管生成和肿瘤演进[2]。本研究采用免疫组化En Vision法检测Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）组织中的表达，分析3者在IDC中的表达及其临床意义，并探讨Foxp3、NRP1和NRP2表达的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 收集本院2010年1月至2012年9月手术切除乳腺IDC石蜡标本108例。患者年龄22～82岁，中位年龄53.6岁；均为女性。均经手术和病理证实且术前均未接受放、化疗及内分泌治疗；依据WHO（2003）乳腺肿瘤组织学标准分级：Ⅰ级21例，Ⅱ级58例，Ⅲ级29例；参照2002年美国癌症联合委员会第6版乳腺癌

TNM分期标准：Ⅰ期16例，Ⅱ期56例，Ⅲ期28例，Ⅳ期8例；腋窝淋巴结转移阳性52例，阴性56例；采用2009年美国临床肿瘤协会和美国病理家协会指定的《乳腺癌HER-2基因临床检测指南》评分标准判定人类表皮生长因子受体2（HER-2）表达：阳性27例，阴性81例。另选取45例纤维腺瘤和66例正常乳腺组织（距离乳腺癌组织边缘＞5cm，并经病理检查证实）石蜡标本作为对照组。本文所使用的组织材料均经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法 采用En Vision二步法进行免疫组化染色，抗原修复方法采用高压锅柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）煮沸法，一抗反应条件为4℃过夜，二抗条件为37℃，0.5h，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明并封固。用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。鼠抗人Foxp3单克隆抗体（1∶50）购自英国Abcam公司，鼠抗人NRP1单克隆抗体（1∶200）和兔抗人NRP2单克隆抗体（1∶100）购自美国Santa Cruz公司，即用型兔抗羊和兔抗鼠免疫组化En VisionTM检测试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 结果判定 Foxp3、NRP1、NRP2、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性信号表现为棕黄色或棕黄色颗粒。Foxp3、ER和PR主要定位于细胞核，NRP1和NRP2主要定位于细胞质。结果用双盲法进行评估。每张切片随机观察5个以上高倍视野（×400），总计数不少于1 000个细胞中的阳性细胞数，染色细胞数≥10%为阳性，＜10%为阴性。Her-2免疫组化判断：Her-2细胞膜棕黄色为阳性，任何比例的肿瘤细胞有微弱、不完整的细胞膜着色或不着色为+或-；＞10%的肿瘤细胞细

胞膜棕黄色着色为++；＞10%的肿瘤细胞细胞膜棕褐色着色为+++。其中-、+、++视为阴性，+++视为阳性。

1.4 基因分型标准 依据免疫组化结果，根据2011年St.Gallen国际乳腺癌会议专家共识[3]，采用Cheang等[4]根据ER、PR、HER-2、Ki-67四种免疫组织化学结果进行乳腺癌分子分型。Luminal A型：ER+，和（或）PR+，Her-2-，Ki-67低表达。Luminal B型：其一为ER+，和（或）PR+，Her-2-，Ki-67高表达；其二为ER+，和（或）PR+，Her-2+，Ki-67任意表达。基底细胞样型：ER-，PR-，Her-2-，Ki-67任意表达。Her-2过表达型：ER-，PR-，Her-2+，Ki-67任意表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件；不同组织间Foxp3、NRP1和NRP2表达差异比较采用χ2检验，Foxp3、NRP1和NRP2两两表达的相关性采用Spearman秩相关分析。

2 结果

2.1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纤维腺瘤和正常乳腺组织中的表达 Foxp3阳性信号主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒，在乳腺IDC组织中呈弥漫表达，见图1a；在对照组织阳性表达率极低，仅表达于导管上皮细胞，见图1b。NRP1阳性信号主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，在乳腺癌组织阳性率较高，见图1c；在对照组织阳性表达强度较弱，见图1d。NRP2阳性信号主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，在乳腺癌组织阳性率较高，见图1e；对照组织阳性表达率较低，见图1f。Foxp3、NRP1和NRP2在正常乳腺组织、纤维腺瘤和乳腺IDC中阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纤维腺瘤和正常乳腺组织中的表达（a：Foxp3在乳腺IDC组织中的表达；b.Foxp3在正常乳腺组织中不表达；c.NRP1在乳腺IDC组织中的表达；d.NRP1在正常乳腺组织中的表达；e.NRP2在乳腺IDC组织中的表达；f.NRP2在乳腺纤维腺瘤组织中不表达；En Vision二步法×100）

表1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纤维腺瘤和正常乳腺组织中的阳性表达情况[例（%）]

2.2 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中阳性表达与临床病理因素的关系 Foxp3表达在乳腺IDC中随着组织学分级升高、TNM分期进展及淋巴结转移其阳性率分别递增，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤大小均无关（均P＞0.05）。NRP1和NRP2阳性表达与患者年龄、肿瘤大小及组织学分级均无关（均P＞0.05），与淋巴结转移和TNM分期密切相关（均P＜0.05），见表2。

表2 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中阳性表达与临床病理因素的关系[例（%）]

2.3 Foxp3、NRP1和NRP2阳性表达与乳腺IDC基因分型的关系 各亚型间Foxp3阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05），但各亚型间NRP1和NRP2阳性表达率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。乳腺癌基底细胞样型及Luminal A型组中NRP1和NRP2阳性表达率均明显低于Luminal B型和Her-2过表达组（均P＜0.05）。乳腺癌Her-2过表达组NRP1和NRP2阳性率均高于Luminal B型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 Foxp3、NRP1和NRP2表达与乳腺IDC基因分型的关系[例（%）]

2.4 Foxp3、NRP1和NRP2表达在乳腺IDC中的相关性 NRP1和NRP2在乳腺IDC中表达均与Foxp3表达呈正相关（r=0.42、0.41，均P＜0.05），NRP1表达与NRP2表达呈正相关（r=0.50，P＜0.05）。

3 讨论

Foxp3属于具有叉头螺旋结构为特征、多种功能的蛋白分子大家族成员，主要表达于CD4+CD25+Treg，在一定程度上可反映Treg的水平和功能活性。Treg以细胞膜特异性表达CD4和CD25为特征，是形成肿瘤免疫耐受的重要部分。Foxp3+CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫逃逸过程中起关键性作用[5]，因此对Foxp3的研究主要集中于Treg。近年来研究发现，Foxp3不仅仅表达于Treg，而在某些实体肿瘤组织和细胞中也存在不同程度的表达。免疫组化染色结果显示，肿瘤组织内Treg和肿瘤细胞均表达Foxp3。79.3%的印戒细胞癌患者存在Foxp3表达，且Foxp3表达与淋巴结转移显著相关。肿瘤细胞中Foxp3表达可能在胃癌免疫逃逸过程中扮演重要作用，并与胃硬癌的恶性潜能相关[6]。Wang等[7]研究证实，胶质瘤细胞中Foxp3表达在高级别胶质瘤发展中起关键性作用，并与高级别胶质瘤的恶性生物学行为有关，Foxp3高表达者较低表达者预示预后不良。本研究显示，Foxp3在乳腺IDC中阳性表达率明显高于纤维腺瘤和正常乳腺组织，差异有统计学意义，提示Foxp3过表达可能与乳腺癌的发生有关。Foxp3表达在乳腺IDC中随着组织学分级升高、TNM分期进展及淋巴结转移其阳性率分别递增，差异有统计学意义，而与患者年龄、肿瘤大小无相关性，表明Foxp3表达程度与乳腺癌的转移能力密切相关，与Yoshii等[6]在胃癌中研究结果一致。本研究显示Foxp3表达与乳腺IDC基因分型无关，表明Foxp3表达对于预测乳腺癌患者预后意义及指导内分泌治疗意义小。

NRP家族属于细胞膜表面跨膜糖蛋白，包括NRP1和NRP2两个成员，调节血管和神经系统发育的许多不同方面。NRP1在血管内皮作为血管内皮生长因子A亚型受体，在淋巴管瓣膜内皮作为轴突导向因子（semaphorin）受体；NRP2通过血管内皮生长因子C诱导淋巴管生长；通过与血管内皮生长因子作用来阻止肿瘤细胞凋亡和调节血管生成[8-9]。NRP是多功能共受体，参与肿瘤的发生、生长、转移和免疫，可作为抗癌药物发展很好的靶向[10]。采用短发夹RNA技术敲出NRP1可抑制舌鳞癌的侵袭和转移，考虑到NRP1在舌鳞癌中存在高表达，其可以作为舌癌分化的一个有用标志物和舌癌治疗的一个靶向[11]。有研究报道，NRP2基因和蛋白均与大肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Duke分期和淋巴管密度相关，NRP2表达可能调节淋巴管生成，并且在大肠癌发生和发展中扮演重要作用[12]。

本研究证实，乳腺IDC组织中NRP1和NRP2阳性表达率远高于纤维腺瘤和正常乳腺组织，差异有统计学意义，表明NRP1和NRP2可能是两种癌基因。NRP1和NRP2高表达与临床分期、淋巴结转移有关，而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级无关；提示NRP1和NRP2异常表达均参与乳腺癌的淋巴结转移过程，并与乳腺癌预后密切相关。推测NRP1和NRP2可能通过与血管内皮生长因子受体结合，刺激血管或者淋巴管内皮细胞增殖，促进新生毛细血管网的建立，提高血管通透性，进而促进肿瘤的转移。NRP1和NRP2阳性表达率均与乳腺癌基因分型亚型明显相关。Luminal B型和Her-2过表达组中存在Her-2及NRP1和NRP2过表达，提示预后差。NRP1和NRP2联合检测可能对于评估乳腺癌患者预后和指导内分泌治疗具有重要临床意义。

Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中表达经等级相关分析结果显示，Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺癌中的表达两两呈正相关。提示3者在乳腺IDC的发生和发展过程中起协同作用。联合检测Foxp3、NRP1和NRP2对于评估乳腺癌的生物学特性、预后和指导治疗具有重要的临床价值。

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Expressions of Foxp3,Neuropilin-1 and Neuropilin-2 in infiltrating ductal breast carcinoma and their significance

TAO Deyou，WU Liping，HU Jinxi.Department of Surgery,Luqiao Hospital of Enze Medical Group,Taizhou 318050,China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Foxp3,Neuropilin-1(NRP1)and Neuropilin-2(NRP2)in infiltrating ductalcarcinoma (IDC)ofthe breast and their significance.Methods The expressions ofFoxp3,NRP1 and NRP2 were detected by immunohistochemicalEn Vision method in 108 cases ofIDC ofthe breast,45 cases offibroadenoma,66 cases ofnormal breast tissue.The relationship of foxp3,NRP1 and NRP2 expression with clinical pathological features and genotyping of breast carcinoma was analyzed. Results The expressions of Foxp3,NRP1 and NRP2 in breast IDC were significantly higher than those in fibroadenoma and normal breast tissue (all P＜0.05).The expression of Foxp3 in IDC of the breast was correlated with histological grade,lymph node metastasis and TNM stage (all P＜0.05);the expression of NRP1 and NRP2 was correlated with lymph node metastasis and TNMstage(all P＜0.05).There was a positive correlation among Foxp3,NRP1 and NRP2(all P＜0.05). Conclusion The expressions of Foxp3,NRP1 and NRP2 are up-regulated in IDC of the beast,indicating that the combined detection of Foxp3,NRP1 and NRP2 may be used for evaluation ofbiologicalbehavior and prognosis ofbreast carcinoma.

Foxp3 Neuropilin-1 Neuropilin-2 Breast carcinoma Gene type

2016-01-06）

（本文编辑：陈丽）

台州市科技计划项目（102KY13）；台州恩泽医疗中心（集团）科研基金（15EZA3）

318050 台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院外科（陶德友、吴丽平）；浙江省台州医院肿瘤外科（胡金喜）

陶德友，E-mail：9890830@qq.com