FTIR技术结合区间偏最小二乘法快速测定油脂中反式脂肪酸

叶 沁 潘丹杰 栗 磊 杨志成 孟祥河

(浙江工业大学海洋学院1, 杭州 310014) (杭州市粮油中心检验监测站2, 杭州 310009)

FTIR技术结合区间偏最小二乘法快速测定油脂中反式脂肪酸

叶 沁1潘丹杰2栗 磊1杨志成2孟祥河1

(浙江工业大学海洋学院1, 杭州 310014) (杭州市粮油中心检验监测站2, 杭州 310009)

研究了傅里叶红外光谱技术结合区间偏最小二乘法(iPLS)快速分析食用油中低含量(0.1%～5%)反式脂肪酸的分析方法。通过系统地比较衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)及衰减透射红外光谱法(TR-FTIR)光谱的模型效果，优化建模区间。研究结果表明，ATR-FTIR、TR-FTIR-PLS回归模型均能有效测定油脂中低浓度反式脂肪酸的含量，但TR-FTIR法灵敏度优于ATR-FTIR法。iPLS区间选择结果显示，以1 000～940 cm-1波段透射光谱建模，相关系数R2为0.998 8，标准集的RMSEC 0.016 6，验证集RMSEP为0.008 75，预测相对标准偏差2.92%，预测值与实际值高度相关，Y预测=1.00X实际-0.003 44，R2=0.998 7。12组外部验证试验相对标准偏差为4.80%，说明预测精确度较高、模型稳定性好，有潜力替代传统气相色谱法用于油脂中低含量反式脂肪酸快速定量测定。

FTIR iPLS 反式脂肪酸 油脂

反式脂肪酸(TFAs)是一类分子结构中含有非共轭反式双键的不饱和脂肪酸[1]。研究表明，TFAs与血脂代谢，血管炎症和心脑血管疾病的发展变化之间有很强的相关性[2]。传统的油和脂肪中反式脂肪酸的分析一般采用气相色谱(GC)技术。该方法准确度高，但需要脂类衍生化处理，耗时长，需要昂贵的标品及良好的试验技能。与此相反，快速的测定方法，例如近红外，拉曼和中红外光谱(FTIR)也被应用于食物中脂肪酸的 分析[3-5]。

傅里叶变换中红外光谱法克服了传统的化学法需要甲酯化、使用有毒性、有害试剂等缺点，操作简单，重复性高，时间短。其不足是灵敏度低，不适合于TFAs含量小于0.5%的样品。本试验对比研究了FTIR透射光谱与ATR-FTIR光谱快速定量分析TFAs技术，同时结合区间偏最小二乘法(iPLS)优化了定量模型，开发了低TFAs含量样品的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

反式亚油酸甲酯C18:2(纯度≥99%)：美国Nu Check公司；正己烷(色谱纯)：美国 Tedia 公司；精炼大豆油、菜籽油、花生油：市售。

BRUKER TENSOR 27傅里叶红外光谱仪(配有ATR采样系统、TR样品池、OPUS 操作软件)：德国布鲁克公司。

1.2 标准样品的制备

将反式脂肪酸标准样品分别按比例溶于大豆油、菜籽油和花生油中。用作标准曲线制备的反式亚油酸甲酯的加入比例分别为：5%、3%、1%、0.7%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.15%、0.1%、0.05%，共得36个校正集样品。精确配置成总体积为5 mL的混合溶液，摇匀，静置后备用。精确移取1 mL配置好的标准样品，用5倍(V/V)色谱级的正己烷稀释，摇匀，静置后作为透射标准样品备用。另配置11个样品作为验证集，反式亚油酸甲酯加入比例为5%、3%、1%、0.7%、0.4%、0.2%、0.1%，随机溶于大豆油、菜籽油和花生油中，摇匀静置后，同样精确量取1 mL，分别以1∶5稀释混匀。

1.3 红外光谱的采集

全反射样品的采集，取适量样品均匀地涂在ATR 附件的晶体材料(ZnSe) 上，使其完全覆盖晶体表面，OPUS软件记录4 000～400 cm-1的吸收光谱，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次，测量环境的湿度需小于70%，温度保持在25 ℃。

透射样品的采集，样品池用色谱纯正己烷润洗5遍后，用待测样品润洗3遍，上样， 记录光谱。

1.4 模型的建立

采用TQ Analyst光谱分析软件对所得红外光谱进行预处理及分析，通过对红外光谱进行预处理，可以优化所建立的模型。预处理方式一般包括一阶导数，二阶导数，自动平滑等。在光谱采集过程中，光谱噪声会造成偏最小二乘法出现微小偏差，影响模型的稳定性。因此，本研究采用将光谱采集后自动平滑，从而提高模型的稳定性。

1.5 模型稳定性的验证

对于所建的模型，需要对其稳定性进行验证。将反式亚油酸甲酯随机溶于大豆油、菜籽油和花生油，掺入比例随机配制12个预测集样品。主要预测指标有校正相关系数(R)，交叉验证误差均方根(RMSECV)，预测均方差(RMSEP)，预测相对偏差(RPD)。

1.6 区间偏最小二乘法(iPLS)

选择合适的波段能使所建立的模型具有更好的稳定性。本试验将采用区间偏最小二乘法(iPLS)对光谱波段进行优化。区间偏最小二乘法(iPLS)建模是根据偏最小二乘法回归模型将谱图波段分成更小的区间。将每个子区间计算所得的交叉验证误差均方根(RMSECV)与全波段下的数值相比，然后选择所得RMSECV较小的子区间[6]。该方法的一个主要优点是采用局部回归建模的方法，主要体现在根据比较每一个子区间的模型和全波段模型比较，最后选择确定最优区间[7-8]。

1.7 数据处理

利用 TQ Analyst 光谱分析软件进行定标模型的建立，建立导入的预测样品根据建立的模型进行数学运算从而得出预测样品的反式脂肪酸的浓度。

2 结果与分析

2.1 食用油的红外吸收光谱

由于孤立反式双键中CH官能团的平面振动变形，反式脂肪酸在966 cm-1处表现特征吸收，吸收强度和反式脂肪酸在油样中的含量相关[11]。随着反式亚油酸甲酯含量的增加，966 cm-1处的吸收峰也随之增加，吸收强度也随之变大。

b 1∶5不同反式脂肪酸含量的食用油、正己烷溶液的TR-FTIR光谱图

图1 食用油中定量添加反式脂肪酸的红外光谱图

2.2 模型的优化

2.2.1 经典PLS

根据各特征官能团所在的波段，将全反射及透射光谱(4 000～600 cm-1)分为6个波段，其相应区间所对应的特征官能团及建模结果见表1。研究采用交叉验证误差均方根(RMSECV)，预测方差(RMSEP)以及相关系数(R) 3项指标综合评价模型的准确性，结果显示无论是全反射法还是透射法均是基于990～920 cm-1波段所建立的模型较好，其R值最接近1，且RMSECV最小，但RPD的值均偏高，所建立模型并不理想。

表1 ATR和TR经验PLS波段选择结果

注：RMSECV：交叉验证误差均方根， RMSEP：预测方差，R：相关系数，RPD：预测相对偏差，余同。

表2 ATR和TR区间偏最小二乘法(iPLS)波段选择结果

2.2.2 iPLS

因此本试验引入区间偏最小二乘法(iPLS)对全反射和透射波谱的最优波段进行选择。全波段(4 000～600 cm-1)依次分成10、20、34、43、58个区间，依次建模，结果见表2。从表2中可以看出，在全反射和透射中，最优建模区间均为1 000～940 cm-1(全波段分为58个区间)。在此波段上，利用全反射光谱建模所得RMSECV为0.076，RMSEP为0.090 5，R为0.998 8，利用透射建模所得RMSECV为 0.016 6，RMSEP为0.008 75，R为0.998 8。但透射的RPD值(2.92%)小于全反射RPD值(8.24%)。由此可以看出波谱区间选择对提高模型稳定性的重要性。

2.3 模型的验证和预测

选取按一定比例添加反式亚油酸甲酯的大豆油、菜籽油、花生油共11组，作为验证集，采用基于iPLS-58区间的FTIR/ATR和FTIR/TR最优模型进行验证。预测效果如图2所示。TFAs的预测结果均与实际值高度相关，斜率均为1，截距接近0，说明开发的TFAs的FTIR/TR、ATR/FTIR分析模型准确度较高。于修烛等[12]，陶健等[11]分别探讨了FTIR-ATR技术结合二阶导光谱测定油脂中反式脂肪酸，得到了较好的结果，但其主要针对TFAs含量高于0.5%的样品。本研究开发的FTIR透射光谱与ATR-FTIR光谱模型均可准确预测低TFAs含量，尤其适合TFAs小于0.5%的样品。

图2 样品标准集和预测集拟合曲线

2.4 准确性试验

随机配制12组低反式亚油酸甲酯含量的样品验证分析模型的准确性，见表3。其中FTIR/ATR模型预测组的平均相对误差为6.34%；FTIR/TR预测组为4.80%。da Costa Filho[13]采用FTIR-ATR结合偏最小二乘法(PLS)技术检测食用油中小于1%的反式脂肪酸含量，所得相关系数为0.982。黄向荣[14]等采用气相色谱法测定50份动物油脂中的反式脂肪酸(5.15%～7.67%)，相应RSD为3.52%～4.63%。对比发现，本研究所采用的全反射傅里叶转换红外光谱法结合区间偏最小二乘法不仅避免了GC法复杂、费时的样品前处理，同时也实现了油脂中低含量(<0.5%)反式脂肪酸的检测，准确度较高。此外，数据显示TR-FTIR法的准确度优于ATR-FTIR法。

表3 ATR准确性验证结果

3 结论

建立了基于傅里叶变换红外光谱技术的油脂反式脂肪酸的快速测定方法，分析时间从传统GC方法的2～3 h缩短到3～5 min。经分析比较发现，水平衰减全反射傅里叶变换红外光谱法和透射傅里叶变换红外光谱法均可以用于反式脂肪酸含量的快速测定。其中，透射法线性关系和准确度明显更好，且灵敏度也较高，对反式脂肪酸含量<0.5%以下的样品亦有较高的参考价值。在模型建立方面，无论是全反射法还是透射法均是基于1 000～940 cm-1波段所建立的模型预测效果更好，其中ATR-FTIR组的R值为0.998 8，RMSECV为0.076，TR-FTIR组的R值为0.998 8，RMSECV为0.016 6。与经典的GC法相比，省略了繁琐的脂肪酸皂化、甲脂化等样品前处理过程，且实验成本也大大降低，测定和计算过程也简化了很多。

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Rapid Determination of Trans-Fatty Acids in Oils and Fats by FTIR Technology Combined with IntervalPartial Least Squares

Ye Qin1Pan Danjie2Li Lei1Yang Zhicheng1Meng Xianghe1

(Ocean College，Zhejiang University of Technology1，Hangzhou 310014)(Hangzhou Grain and Oil Center Inspection Station2，Hangzhou 310009)

In order to rapidly analyze the low level (0.1%～5%) trans fatty acids in edible oils, FTIR technology combined with interval partial least squares is studied in this paper. The effects of attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and Fourier transform infrared spectroscopy (TR-FTIR) models are systematically compared for optimization of spectral modeling interval. The results show that both ATR-FTIR regression model and TR-FTIR-iPLS regression model are effective in term of determination of low level trans fatty acids in oils. However, TR-FTIR method has higher sensitivity than that of ATR-FTIR method. The results of iPLS interval selection demonstrate that when transmission spectra model is established based on 1 000～940 cm-1, coefficient of correlationR2(0.998 8), RMSEC of 0.016 6, RMSEP of 0.008 75 and relative standard deviation of 2.92% are obtained. The FTIR/TR predictive values are highly correlated with the actual values with a regression equation ofYprediction= 1.00Xactuality-0.003 44,R2=0.998 7. The relative standard deviation of 12 groups of external validation tests (4.80%) shows that the model has higher prediction accuracy, and better stability. It is potential for TR/FTIR-iPLS method to be taken as an alternative to the traditional gas chromatography for rapid determination of low concentration of trans fatty acids in oils.

FTIR，iPLS，trans fatty acid，oil，determination

TQ646.4

A

1003-0174(2016)10-0137-05

国家自然科学基金(31271887)，杭州市社会发展科研专项( 20140533B20)

2015-02-07

叶沁, 女，1989年出生,硕士，油脂分析检测

孟祥河，男，1974年出生，教授，粮油深加工技术