液质联用法检测粮谷制品中4种单端孢霉烯类真菌毒素

张家宁 丁 轲 郭思梦 韩 涛 陈湘宁

(北京农学院食品科学与工程学院；食品质量与安全北京实验室；农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206)

液质联用法检测粮谷制品中4种单端孢霉烯类真菌毒素

张家宁 丁 轲 郭思梦 韩 涛 陈湘宁

(北京农学院食品科学与工程学院；食品质量与安全北京实验室；农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206)

建立粮谷制品中4种单端孢霉烯类真菌毒素的液相色谱—质谱联用分析方法。样品经乙腈/水溶液(84∶16，V/V)提取后用Mycosep®226多功能柱净化，Agilent ZORBAX Bonus-RP色谱柱分离，液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)测定。结果表明，样品中4种单端孢霉烯类真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.995，检出限为2～5 μg/kg，3个加标水平下平均回收率为73.19%～107.39%，相对标准偏差为1.46%～13.24%。表明该方法净化效果好、灵敏度高，适用于同时检测单种粮谷制品中4种单端孢霉烯类真菌毒素的残留量。

单端孢霉烯类真菌毒素 液相色谱—串联质谱 粮谷制品

单端孢霉烯类真菌毒素是镰刀菌毒素中一大族化学性质相关的真菌毒素，目前已知的有200多种[1]。单端孢霉烯类真菌毒素对人畜健康有很大的危害[2-6]，且其污染已成为粮食减产和质量下降的主要原因，对全球的粮食贸易具有重要影响[7]。据流行病学调查显示，单端孢霉烯类真菌毒素广泛存在于各种粮食作物(如小麦、玉米、大麦、燕麦等)和加工产品(如啤酒和面包等)，多见于潮湿环境中储藏的发霉粮食中[2]。经常从受污染的粮食和饲料中被检出的有4种：T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA，具有分布范围广、污染粮食及其制品的种类多等特点。

单端孢霉烯类真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)[8]，气相色谱法(GC)[9]，气质联用法(GC-MS)[10]，高效液相色谱法(HPLC)[11]和液质联用法(LC-MS或LC-MS/MS)[12-16]等。其中，液质联用法以其快速、灵敏和检测范围大等优点广泛应用于谷物、饲料、婴儿食品等基质中的单端孢霉烯类真菌毒素多目标检测。采用多功能净化柱结合LC-MS/MS方法同时检测粮谷制品(小麦粉、玉米粉)中的4种单端孢霉烯类真菌毒素：T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA。

1 材料与设备

1.1 试验材料

试验样品：不同品牌不同产地的7种小麦粉、玉米粉。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(5 mg)、玉米赤霉烯酮(5 mg)、T-2毒素(5 mg)、HT-2毒素(100.0±0.20 μg/mL)，均用甲醇溶解并定容至10.0 mL作为标准储备液，浓度为100 μg/mL，于 4 ℃条件下避光保存；10 mmol/L乙酸铵溶液，乙酸铵为色谱纯。

1.2 仪器设备

液相色谱-质谱联用仪：Agilent 1200-ESI 6410，美国安捷伦公司；Mycosep®226、Mycosep®227多功能净化柱：Pribolab；BF-2000氮气吹干仪：北京八方世纪有限公司；SUPER SERIES超纯水系统：艾科普。

2 试验方法

2.1 样品前处理

2.1.1 毒素提取

称取小麦粉或玉米样品25.0 g (精确至0.1 g)于500 mL具塞锥形瓶中, 加入100 mL乙腈/水(84∶16，V/V)提取液，浸泡15 min，超声震荡40 min，过滤，取8 mL 滤液，过MycoSep®227或MycoSep®226多功能柱，取过柱后液体4 mL，N2吹干，甲醇溶液定容至1 mL。

2.1.2 多功能柱的选择和样品净化

根据已有研究[18-19]，选取Mycosep®226、Mycosep®227柱进行样品净化，将2种多功能净化柱的过柱效果进行比较。

选取1种面粉样品作为空白，按照2.1.1的方法进行样品提取，取8 mL的滤液后，向面粉中加入不同浓度梯度的4种真菌毒素标样，分别过Mycosep®226、Mycosep®227柱，进行过柱效果比较试验，用方差分析比较其是否存在差异。

2.2 液相色谱-质谱条件的选择

2.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)。

保持流速(0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min)、柱温(30、40、50、60 ℃)及流动相比例3个条件中的其中2个不变，改变另外1个，测定浓度为100 ng/mL的4种真菌毒素混合标准溶液的色谱峰面积，确定出最佳的流速、柱温及流动相比例。

2.2.2 质谱条件

离子源: 电喷雾离子源，离子源温度: 300 ℃；干燥气流速: 6 L/min；离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)；质谱扫描方式：多反应检测(MRM)；扫描范围：100～500 amu；用SIM 选择离子扫描做定量分析；离子驻留时间：300 msec；雾化气压力为15 psig(1 psig=6 894.76 Pa)。

在试验条件一定的情况下，分别以正离子模式和负离子模式对4种真菌毒素进行检测，毛细管传输电压在2 000～5 000 V的范围内，碎裂电压在 50～250 V之间选择；并在MRM监测下，选择4种真菌毒素监测的子离子峰出峰状态最好时的碰撞能量值。

2.3 4种真菌毒素的定量分析

2.3.1 方法的线性范围及定量限

以本方法确定的试验条件，将配置的混合系列标准溶液进行测定，以峰面积(Y)对相应真菌毒素的浓度(X)绘制标准曲线进行回归分析，得到线性回归方程、线性范围及相关系数。

如2.1.1的方法，准确称取若干份相同的面粉样品各25 g，向面粉中添加4种真菌毒素标准溶液，并逐步减少添加量，降低面粉中4种真菌毒素的浓度，处理后上机检测。直到在仪器信噪比为3∶1 时，SIM 扫描中选择离子不再有峰出现，此时面粉中4种真菌毒素的浓度即为方法的检出限(LOD)；再根据仪器信噪比为10∶1 时计算定量下限(LOQ)。

2.3.2 方法的回收率与精密度

如2.1.1的方法，准确称取若干份相同的面粉样品各25 g，向面粉中加入与2.1.2中等量的不同浓度梯度的4种真菌毒素标样，混匀，静置0.5 h。按上述建立的方法对毒素进行提取、MycoSep®226柱净化、上机检测。同时对不加毒素的面粉样品进行检测。每1个样品做3个平行，重复测定3次。通过结果计算回收率，并计算相对标准偏差(精密度)。

2.4 面粉样品及粮谷制品的检测

选取不同产地、不同品牌的7种小麦粉、玉米粉样品：5种小麦粉，2种玉米粉；7种面粉的采购地点有4种为大型超市，3种为集贸市场散称面粉。7种面粉样品分别称取25 g，如2.1.1的方法提取、净化，上机检测，每个样品做3个平行，重复测定3次。

3 结果与分析

3.1 多功能柱的选择

选取一种面粉样品作为空白进行过柱效果回收率实验的结果见表1，通过对结果进行方差分析，结论如下：对于DON、HT-2、T-2毒素，Mycosep®226、Mycosep®227的差异并不显著(P>0.05)：DON的过柱效果Mycosep®227略优于Mycosep®226；HT-2和T-2 则是采用Mycosep®226柱效高。对于ZEA，Mycosep®226、Mycosep®227的差异极显著(P<0.01)，Mycosep®226的回收率明显高于Mycosep®227。综合4种单端孢霉烯类真菌毒素同时净化的柱效分析，Mycosep®226柱为最优选择。

表1 不同多功能柱的回收效率比较

3.2 液相色谱-质谱条件

3.2.1 液相色谱条件

经过试验可得，最适柱温40 ℃，进样量为20 μL。流动相采用乙酸铵水溶液(A)-乙腈溶液(B)体系，流速为0.3 mL/min，梯度条件：0～0.1 min，B为10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B为80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。

3.2.2 质谱条件

4种真菌毒素的质谱参数见表2。

表2 4种真菌毒素的质谱参数

注：*为定量离子。

3.2.2.1 DON正负离子扫描模式的选择

4种真菌毒素同时检测的条件下，当DON的电离模式为ESI-时，母离子为295，此条件下DON出峰的峰形较差，响应值较低。改用ESI+电离模式监测，DON可以加和钠离子，母离子为319，峰形有很大改善，且响应值增大，所以确定其质谱条件为ESI+电离模式，母离子为319。

DON含羧基可以使用负离子模式，因为在一般情况下可以电离为R-COO-；但在乙酸铵存在的流动相中，羧酸根不容易电离成负离子，这时负离子监测的灵敏度下降，所以在正离子ESI+电离模式峰形较好，响应值较高。

3.2.2.2 毛细管传输电压对ZEA质谱检测的影响

毛细管传输电压是加在毛细管入口端的电压。正离子模式电压范围2 000～5 500 V，负离子模式一般2 000～4 000 V，根据化合物极性及利于电离的原则可适当调高或调低，半圆柱体形电极和毛细管之间的电位差是恒定的500 V(正离子模式，前者电压高，负离子模式，后者电压高)，若毛细管传输电压过高，导致半圆柱体形电极电压过高，易产生放电破坏化合物，从而影响其监测结果。

质谱条件优化过程中，正离子模式下毛细管传输电压在2 000～5 500 V的改变对3种真菌毒素(DON、HT-2、T-2)的检测结果影响不显著，只需改变碎裂电压和碰撞能量来优化检测条件；但负离子模式下毛细管传输电压的改变对ZEA的出峰情况有显著影响，经试验证明，毛细管传输电压在2 000～4 000 V的范围内选择，2 500 V时ZEA的出峰情况最好。因此，正离子模式(ESI+)毛细管传输电压选择4 000 V；负离子模式(ESI-)毛细管传输电压选择2 500 V。

3.3 4种真菌毒素的定量分析结果

3.3.1 方法的线性范围及定量限

以峰面积(Y)对相应真菌毒素的浓度(X)绘制标准曲线进行回归分析(见表3)，结果表明4种单端孢霉烯类真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数在0.995以上，定量下限5～20 μg/kg。4种真菌毒素在测定方法定量限时的标准溶液TIC图见图1。

表3 4种单端胞霉烯族真菌毒素的线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量下限

图1 4种单端孢霉烯类真菌毒素标准溶液的TIC图

3.3.2 方法的回收率与精密度

本方法采用4种单端孢霉烯类真菌毒素最低的面粉作为空白样品基质，测定其精密度及回收率，结果见表4，3个加标水平下平均回收率为73.19%～107.39%，相对标准偏差为1.46%～13.24%，符合痕量分析的要求。

3.3.3 样品提取环节对方法回收率影响的分析

根据3.1过Mycosep®226柱得到的4种毒素的回收率(提取后序环节回收率)结果与3.3.2过Mycosep®226柱得出的整个分析方法4种毒素回收率(方法回收率)的结果进行比较，用方差分析的方法分析样品提取环节对4种真菌毒素回收率的影响。若P>0.05，则差异不显著，即样品提取环节对方法回收率影响不大；P<0.05，则差异显著，说明样品前处理环节对方法回收率影响显著。

表4 4种单端孢霉烯类真菌毒素添加回收率和精密度

样品前处理包括样品提取和过柱净化，2.3.2方法回收率的测定是在样品前处理时就加入4种真菌毒素的标样，2.1.2则是在过柱之前添加，两者结果相比较，则可检验出样品提取环节对方法回收率的影响。结果见表5：4种真菌毒素在过柱前添加标样测定回收率的值与方法回收率的值相比都有显著差异， HT-2和T-2差异极显著。这说明在样品提取环节4种真菌毒素均有不同程度的显著损失。本试验选取了已有研究中最优的提取方法，但样品提取环节仍有显著损失，开发新的提取方法将损失降到最低可作为今后的研究方向。

表5 提取后序环节回收率和方法回收率的比较

注:P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.000 1为差异极显著。

3.4 面粉样品及粮谷制品的检测

对7种小麦粉、玉米粉样品进行检测，DON，HT-2，T-2 3种真菌毒素的检出率为100%，仅1、3、4、5号面粉样品中检出含有ZEA，且4号集贸市场所购细玉米粉中4种真菌毒素含量均为最高。

GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》中对小麦、玉米、大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON和玉米赤霉烯酮ZEA做了限量，要求 DON≤1 000 μg/kg，ZEA≤60 μg/kg，由表6可知，3、4号玉米粉的ZEA均超过国家限量标准。但至今为止，我国尚未出台HT-2、T-2限量的具体标准，基于对实际检测的应用需要，我国对HT-2、T-2等真真菌毒的限量标准有待完善。

表6 7种面粉样品的检测结果

4 结论

本研究结合使用多功能净化柱，建立了一种同时检测粮谷制品中4种单端孢霉烯类真菌毒素的液相色谱-质谱联用的方法。结果表明，多功能净化柱Mycosep®226对4种真菌毒素的同时净化效果优于Mycosep®227，能使4种真菌毒素均达到较高的回收率，而Mycosep®227柱仅对其中3种效果较好，综合考虑，Mycosep®226为最优选择。此外，该方法对于单端孢霉烯类真菌毒素的多目标检测，具有快速、灵敏、准确的特点，适用于粮谷制品(如面粉等)中4种真菌毒素的同时测定，也为其他基质中多种单端孢霉烯类真菌毒素多目标同时检测提供了参考。

从样品检测的结果看，随机抽取的7种样品有2种ZEA超标，且DON，HT-2，T-2这3种真菌毒素的检出率为100%。由此可见，我国对于控制粮谷制品中单端孢霉烯类真菌毒素含量的监管力度有待加强，相关限量标准有待完善。

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Determination of Four kinds of Trichothecenes in Grain-products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Zhang Jianing Ding Ke Guo Simeng Han Tao Chen Xiangning

(Department of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing 102206)

A simultaneous determination method for four kinds of trichothecenes in grain-products was established using high performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were sequentially extracted by 84% acetonitrile-water solution，and then the extracts were cleaned up with Mycosep®226，separated by Agilent ZORBAX Bonus-RP column and detected by LC-MS/MS. Results indicate as follows：high correlation coefficients(r ≥ 0.995)of four trichothecenes were obtained within their respective linear ranges, and the detection limit for them ranges from 2 to 5 μg/kg；and the average recovery rates in the above three matrices spike at three levels were between 73.19%～107.39%，with a relative standard deviation (RSD) varying from 1.46% to 13.24%. This indicates that this method was of good purification effect and high sensitivity, and suitable for the simultaneous detection of four kinds of trichothecenes in grain-products.

trichothecenes，LC-MS/MS，grain-products

TS201.6

A

1003-0174(2016)12-0153-06

北京市自然科学基金(14L00184)，北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划(CIT&TCD2015 4045)，北京市重点建设学科资助(PXM2009_014207_078172)，2015年北京农学院学位与研究生教育改革与发展(2015YJS034)

2015-03-31

张家宁，女，1990年出生，硕士，食品安全检测技术

丁轲，男，1978年出生，副教授，博士，食品营养与安全