2010－2013年儿童呼吸道标本肺炎衣原体DNA检测分析

王汉斌 华春珍 李伟 尚世强

2010－2013年儿童呼吸道标本肺炎衣原体DNA检测分析

王汉斌 华春珍 李伟 尚世强

肺炎是我国5岁以下儿童死亡的主要原因之一[1]，而社区获得性肺炎（CAP）中约有10%由肺炎衣原体（CP）感染所致[2]。近年来，CP感染率在人群中呈上升趋势[3]，除肺炎外，还可引起咽炎、鼻窦炎和支气管炎等疾病，由于其临床表现呈多样性和不典型性，单纯依靠临床症状或影像学检查不能作出明确诊断，只有病原学检查才对诊断具有重要意义。荧光定量PCR检测具有实时监测、准确性高和交叉污染少等优点，CP-DNA阳性可作为CP感染早期诊断的特异性指标。本研究通过检测罹患呼吸道感染的住院患儿呼吸道标本，分析CP-DNA阳性者的年龄、性别及季节分布和临床特点，为临床CP感染的诊治提供参考，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2010年1月至2013年12月浙江大学医学院附属儿童医院门诊和住院疑似CP感染的患儿共35 662例，其中男22 624例，女13 038例，年龄1d～14岁，平均（1.96±2.96）岁。＜1岁18 326例，1～3岁8 403例，～6岁4 992例，＞6岁3 941例。入选标准[4]：年龄＜14岁；有流涕、鼻塞、咳嗽持续并逐渐加重、呼吸加快等临床症状；病程迁延未愈；就诊前均未经抗生素治疗。

1.2 检测试剂和仪器 PCR荧光检测试剂盒（产品编号：Cat#DA-006）由中山大学达安基因股份有限公司生产，抗CP抗体IgG检测试剂盒（产品编号：YZB/GER 0379-2010）和抗CP抗体IgM检测试剂盒（产品编号：YZB/GEM 1641-2010）由德国欧蒙医学实验诊断股份公司生产。荧光定量PCR扩增仪7500型和StepOnePlus型由美国AB公司生产。

1.3 检测方法

1.3.1 标本采集 患儿标本均在入院后用药前釆集。痰液：用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出的痰液1～3ml（婴幼儿经鼻腔负压抽吸深部合格痰液），密封送检；肺及支气管灌洗液：做纤维支气管镜检查者，用无菌5ml玻璃管收集肺泡灌洗液1～3ml，密封送检；咽拭子：用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密封送检。本组患儿中有8例同时采集2种标本。

1.3.2 CP-DNA检测 采用荧光定量PCR技术，＞1.0×103copies/ml为阳性。具体步骤：（1）痰液：加入4倍体积的0.9%氯化钠溶液，轻轻震荡后置4℃冰箱过夜，用枪头或吸管混匀后吸取1.0～1.5ml至离心管中，12 000r/min离心5min；肺及支气管灌洗液：取灌洗液1.0～1.5ml至离心管中，12 000r/min离心5min，去上清液，沉淀加灭菌0.9%氯化钠溶液1ml混匀，12 000r/min离心5min；咽拭子：向玻璃管中加入1ml灭菌0.9%氯化钠溶液，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，吸取全部液体转移至1.5ml离心管中，120 000r/min离心5min。（2）去上清液，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理101min，120 000r/min离心5min。（3）取上清液进行PCR反应测定，每次操作均设阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品对照，操作过程严格按照操作规程进行。

1.3.3 血清CP-IgM、CP-IgG及细胞检测 血清CP-IgM检测采用酶联免疫吸附法，患者样本吸光度值/上标准品吸光度值＞1.1为阳性；血清CP-IgG检测采用酶联免疫吸附法，结果＞22RU/ml为阳性。细胞计数、白细胞分类正常值参照诸福棠实用儿科学第7版[4]。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 CP-DNA检测结果 所有送检标本CP-DNA阳性70例，总阳性率为0.20%。痰液标本送检31 241例，CP-DNA阳性55例（0.18%）；灌洗液标本送检888例，CP-DNA阳性16例（1.80%）；咽拭子标本送检2 371例，CP-DNA阳性7例（0.30%）。男性患儿CP-DNA阳性42例（0.19%）；女性患儿CP-DNA阳性28例（0.21%），男女患儿CP-DNA阳性率差异无统计学意义（χ2=0.358，P＞0.05）。2010年送检7 633例，CP-DNA阳性5例（0.07%）；2011年送检8 150例，CP-DNA阳性22例（0.27%），2012年送检9 045例，CP-DNA阳性25例（0.28%）；2013年送检10 834例，CP-DNA阳性18例（0.17%），不同年份CP-DNA阳性率差异有统计学意义（χ2=12.383，P＜0.01）。

2.2 CP-DNA阳性者在不同季节和月份的分布情况

2.2.1 不同季节CP-DNA阳性率比较 春季（3～5月份）送检9 050例，CP-DNA阳性21例（0.23%）；夏季（6～8月份）送检 7 734例，CP-DNA阳性 24例（0.31%）；秋季（9～11月份）送检8 898例，CP-DNA阳性14例（0.16%）；冬季（12月～次年2月份）送检9 980例，CP-DNA阳性11例（0.11%），春夏季节的阳性率（0.27%）高于秋冬季节（0.13%），差异具有统计学意义（χ2=8.349，P＜0.01）。

2.2.2 不同月份CP-DNA阳性率比较 研究年限内各月份CP-DNA阳性率范围为0%～0.51%，5月份送检2 731例，CP-DNA阳性14例（0.51%），12月份送检3 476例，CP-DNA阳性0例，每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA阳性率见图1。

图1 每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA阳性率

2.3 CP-DNA阳性患儿的临床特点

2.3.1 一般情况 痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA阳性的70例患儿中，男42例（60.00%），女28例（40.00%）。年龄1个月～13岁，平均（5.9±4.3）岁。＜1岁15例（21.43%），1～3岁10例（14.29%），～6岁8例（11.43%），＞6岁37例（52.86%）。

2.3.2 CP-DNA阳性患儿的临床诊断 70例患儿中，合并其他病原体感染14例（20.00%）：同时存在1种其他病原体检查阳性9例，包括军团菌、肺炎支原体、EB病毒各2例，沙眼衣原体、肺炎链球菌、巨细胞病毒各1例；2种其他病原体检查阳性3例，其中肺炎支原体和肺炎军团菌1例，呼吸道合胞病毒和大肠埃希菌1例，巨细胞病毒和肺炎支原体1例；3种其他病原体阳性1例，包括呼吸道合胞病毒、肺炎军团菌及肺炎支原体；4种其他病原体阳性1例，包括肺炎军团菌、肺炎支原体、沙眼衣原体及EB病毒。56例CP单一感染患儿中，以呼吸道疾病为主54例（96.43%），其中肺炎41例，支气管炎和毛细支气管炎6例，急性上呼吸道感染7例。41例肺炎患儿中，合并胸腔积液5例，伴肺不张5例，伴支气管异物1例，有支气管哮喘3例，伴肺咯血、支气管扩张囊性变及呼吸功能不全1例；另2例患儿无明显呼吸道症状，但罹患急性散播性脑脊髓炎和病毒性脑炎。

2.4 CP-DNA阳性患儿辅助检查结果 血白细胞计数平均（9.6±4.2）×109/K，高于正常21例（30.00%）；中性粒细胞计数平均（5.1±3.9）×109/K，高于正常16例（22.86%）。超敏C反应蛋白送检70例，其中≥8mg/K28例（40.00%）。行血清学检查54例，其中CP-IgM阳性33例（61.11%），CP-IgG阳性25例（46.30%），两者均阳性17例（31.48%）。

2.5 治疗情况 CP感染的住院患儿中治愈出院69例，因家长要求自行出院1例：下呼吸道感染患儿56例均予大环内酯类抗生素对症治疗，其中采用单一阿奇霉素治疗50例（72.86%）；采用单一红霉素治疗4例（5.71%），采用单一克拉霉素治疗1例，采用阿奇霉素治疗1个疗程后疗效欠佳后改红霉素1例；其余患儿予利迈欣（化学名：利巴韦林）、萘夫西林、头孢西丁、苯唑西林等药物，病情亦有所好转。所有患儿住院2～29（8.6±5.8）d。2例无呼吸道症状的患儿使用阿奇霉素和罗氏芬（化学名：头孢曲松钠）治疗后好转出院。

3 讨论

CP是1989年描述的衣原体，系革兰染色阴性，严格细胞内寄生的人类病原体[5]。本组资料显示CP感染患儿在性别上差异无统计学意义，而年长儿的CP-DNA阳性率高于婴幼儿，可能与学龄期儿童活动范围较广，在校园内易发生交叉感染有关。本组受检患儿痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA总阳性率为0.20%，较国内外同类研究低[6-9]。分析造成差异的原因，可能与不同地区的流行高峰、患儿的年龄范围以及检测手段不同有关。本研究结果显示灌洗液标本阳性率显著高于痰液和咽拭子标本，提示灌洗液标本可作为临床检测首选方法。CP是公认的5岁以上儿童常见的呼吸道病原体，而本研究纳入的＜6岁患儿占88.95%，其感染率低于5岁以上患儿，致总阳性率较低。本组2010年阳性率处于低水平，2011和2012年度感染率显著高于其他年度，春夏季节CP-DNA阳性率显著高于秋冬季节，反映了本地区研究年限内CP感染的流行病学特点。从CP-DNA阳性率各月份分布图亦可知，自2011年4月，本地区CP-DNA阳性率已较前明显增加。春夏季节昼夜温差大，儿童抵抗力较差易受感染，学校等教育机构应注意适当通风避免交叉感染。

CP感染除可引发肺炎和上呼吸道感染外，还与哮喘有关，甚至与肥胖、脑炎、心肌炎等许多非呼吸道疾病相关[10-13]。肺炎衣原体也可合并其他病原体感染，包括肺炎链球菌、肺炎支原体、沙眼衣原体、EB病毒、巨细胞病毒和呼吸道合胞病毒等，给临床医师的诊治带来更大的困难，易造成不合理用药，延误病情。实时荧光定量PCR的应用，提高了检测的准确性，在封闭系统内进行操作，最大限度地减少了普通PCR导致的假阳性污染，并实现了准确定量,是CP感染的有效诊断方法[14]。但CP-DNA阳性也不能排除病原体定值可能，因此应根据患儿的临床特点和其他辅助检查结果共同作出判断。本组下呼吸道感染患儿均有相应的X线胸片表现，血清CP-IgM阳性为61.11%，血清CP-IgG占46.30%，两者均阳性占31.48%，符合CP感染的表现。由于初次感染时IgM大约在发病后3周左右出现，IgG在6～8周出现；再次感染时IgM可能不出现，IgG在1～2周出现[15]，因此早期检测可出现假阴性，若能在恢复期复查CP抗体并与急性期比较，则更具有诊断价值。血常规和超敏C反应蛋白是临床常用的检测指标，对鉴别细菌和病毒感染具有重要参考价值。本组CP感染患儿中，血白细胞计数正常或低于正常占70.00%，中性粒细胞比例正常或低于正常占77.14%，而超敏C反应蛋白升高达40.00%，提示血常规正常或低于正常而超敏C反应蛋白升高有助于CP感染诊断。

一旦对CP感染明确诊断，可使用影响CP蛋白质合成的大环内酯类抗生素进行治疗。Hammerschlag[16]报道，小儿CP肺炎用红霉素或克拉霉素治疗10d或阿奇霉素治疗5d，其清除率可达79%～86%。本组资料显示阿奇霉素是治疗CP感染的有效药物，可作为首选药物。但也有十余例患儿好转而未使用针对性抗生素，可能与在增强体质和治疗混合感染的情况下，CP感染有一定自限性有关[17]。

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2015-04-30）

（本文编辑：马雯娜）

310003 杭州，浙江大学医学院附属儿童医院感染科（王汉斌系杭州师范大学医学院在读本科生）

华春珍，E-mail：chunzhenhua@yahoo.com